microRNA在肥胖大鼠脂肪组织中的差异表达

支翠菊，黄 瑛，祁炜罡，张代富



microRNA在肥胖大鼠脂肪组织中的差异表达

支翠菊，黄 瑛，祁炜罡，张代富

目的 建立高脂饮食诱导的大鼠肥胖模型，初步探讨肥胖大鼠脂肪细胞、体质量、体长、血糖、血脂的变化，为进一步研究microRNA在肥胖诱发脂类代谢紊乱的相关分子机制奠定基础。方法 将40只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组和高脂饮食组，分别以基础饲料和高脂饲料喂养，尾静脉采血检测造模前及4周、8周的血糖、血脂水平，8周时眼眶放血处死大鼠；用动物电子秤称量大鼠体重；留取大鼠网膜脂肪组织，用皿式电子分析天平称重，并将其保存在-80 ℃液氮中备用，油红染色光学显微镜观察脂肪组织形态，采用微距阵基因芯片技术筛选肥胖大鼠模型的网膜脂肪组织差异表达的microRNA，Real-Time PCR验证结果。结果 建模8周末，高脂饮食组大鼠体重、网膜组织重量、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白均高于普通饮食组(P<0.01)，高密度脂蛋白低于普通饮食组(P<0.01)。基因芯片检测并经Real-Time PCR验证发现，高脂饮食组大鼠网膜组织中有13个差异表达的microRNA，其中microRNA30a、microRNA7e、microRNA30c、microRNA335、microRNA103、microRNA107、microRNA139-5p表达上调，microRNA494、microRNA140、microRNA342-5p、microRNA382、microRNA17-1-3p、microRNA92a表达下调。生物信息学分析发现，差异表达的microRNA调控的靶基因与细胞增殖、凋亡、糖代谢及调节脂肪细胞分化和脂类代谢生物学功能相关。结论 高脂诱导的肥胖模型大鼠网膜组织中microRNA表达谱发生明显改变，提示microRNA能够调节脂肪细胞分化和脂类代谢。

肥胖；microRNA；基因芯片；血糖；血脂

随着全球经济的快速发展，肥胖已是全世界面临的严峻问题，在发展中国家，超重及肥胖的发病率逐年上升。世界卫生组织(WHO)明确认定肥胖是全球成年人面临的最大慢性疾病，为世界四大医学社会问题之一。中心性肥胖引起胰岛素抵抗伴随胰岛细胞功能障碍，释放胰岛素减少，不能有效地控制血糖水平，进而加速了2型糖尿病的进程，寻找肥胖治疗的新靶点显得很重要[1]。microRNA是一类内源性产生的单链小分子RNA，能够与目标microRNA转录的互补基因序列结合，进而通过转录抑制和MicroRNA干扰导致基因沉默，从而参与和调控了包括时序发育、细胞凋亡、脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程以及多种疾病发生过程[2-3]。近年来，大量研究证明肥胖与某些特异的microRNA有关[4]。但是目前采用芯片来筛查肥胖大鼠脂肪组织中差异表达的microRNA的报道并不多见。本课题建立高脂饮食诱导的大鼠肥胖模型，通过microRNA芯片技术筛查肥胖大鼠网膜脂肪组织中差异表达的microRNA，寻找肥胖诱发脂类代谢紊乱相关的microRNA，从而了解调控脂肪细胞生长的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只健康雄性断乳SD大鼠，6周～7周龄，体重220 g±25 g，斯莱克公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。按体重随机分为对照组(普通饲料喂养)和模型组(高脂饲料喂养)，SPF清洁级百级中分笼喂养，每笼3只～8只，饲料、饮水、垫料、笼具均经消毒灭菌后使用，严格执行清洁级实验动物操作规程，12 h明暗循环，动物自由进食水。

1.2 饲料配方 采用合成饲料喂养大鼠，其中所含营养素和能量能保证大鼠生长发育的基本要求，在此基础上调整脂肪和淀粉含量，配出高脂饲料。普通饲料由斯莱克公司提供，热量比：蛋白质28%，脂肪12%，碳水化合物60%；高脂饲料由斯莱克公司提供：100 g高脂饲料包括基础饲料55 g，猪油30 g，奶粉10 g，蛋黄粉5 g。热量比：蛋白质20%，脂肪60%，碳水化合物20%。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肥胖模型的建立 将40只雄性断乳SD大鼠分为普通饮食组和高脂饮食组，分别以基础饲料和高脂饲料喂养8周。每周称重、测量体长1次，并观察精神状态、引水量、尿量、食欲、大便、毛发光亮度、皮毛、活动、眼睛等。空腹尾静脉采血检测造模前及4周、8周的血糖、血脂水平。造模评定标准：大鼠体重超过标准体重的20%即达到肥胖标准。8周后眼眶放血处死大鼠；用动物电子秤称量大鼠体重；留取大鼠网膜脂肪组织，用皿式电子分析天平称重，并将其保存在-80 ℃液氮中备用。

1.3.2 microRNA芯片检测 microRNA芯片由国药集团提供。用Trizol试剂(国药集团)按照说明书提取大鼠网膜脂肪组织总RNA，用分光光度计测定RNA溶液在260 nm和280 nm下的吸光度值，检测 RNA的浓度和纯度。用1.5%的甲醛变性凝胶电泳(120 V)15 min，在凝胶成像仪下检测总 RNA中 28 s和18 s的完整性。按说明书进行microRNA芯片杂交及芯片洗涤和扫描。高脂饮食组标准值与普通饮食组标准值相比高于2倍或低于0.5倍即认为存在显著性上调或下调趋势。

2 结 果

2.1 肥胖大鼠体重的变化 实验前，普通饮食组和高脂饮食组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。高脂饮食8周后，高脂饮食组大鼠体重较普通饮食组增加了43．80%，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

组别时间n体质量(g)体长(cm)普通饮食组0周19244.55±8.7318.94±1.734周19320.22±5.0523.17±1.388周19385.92±26.5225.68±1.31高脂饮食组0周18246.56±6.0218.72±1.454周18351.72±5.9925.06±1.088周18 473.25±48.501)28.89±1.90 与普通饮食组同时间比较,1)P<0.01。

2.2 油红染色后光学显微镜观察大鼠网膜脂肪组织细胞的比较 与普通饮食组大鼠相比，高脂饮食组大鼠网膜组织的脂肪细胞更大、更圆、更密集。详见图1。

图1 油红染色后光学显微镜观察大鼠网膜脂肪组织细胞

2.3 肥胖大鼠网膜脂肪的变化 高脂饮食8周后，高脂饮食组大鼠网膜脂肪组织重量是普通饮食组的3倍，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 两组大鼠网膜脂肪重量及其重量系数比较

2.4 两组大鼠不同时期的血糖值比较 8周时，高脂饮食组大鼠血糖高于普通饮食组，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

mmol/L

2.5 两组大鼠不同时期血脂指标比较 8周时，高脂饮食组大鼠三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均高于普通饮食组，高密度脂蛋白(HDL)低于普通饮食组，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表4。

mmol/L

2.6 大鼠网膜脂肪组织中差异表达的microRNA 通过microRNA芯片对468个microRNA分析，与普通饮食组相比，高脂饮食组大鼠差异表达的microRNA共有13个，其中上调7个，下调6个。详见表5。

microRNA差异表达的microRNA高脂饮食组/正常饮食组上调的microRNA microRNA30a3.17±0.380.0392 microRNA7e2.68±0.240.0387 microRNA30c1.72±0.120.0382 microRNA3352.23±0.150.0368 microRNA1032.57±0.090.0182 microRNA1073.22±0.180.0164 microRNA139-5p4.54±0.670.0096下调的microRNA microRNA4940.76±0.110.0446 microRNA1400.67±0.060.0438 microRNA342-5p0.42±0.080.0273 microRNA3820.31±0.070.0244 microRNA17-1-3p0.58±0.040.0228 microRNA92a0.38±0.130.0184

3 讨 论

目前世界上有11亿人口超重或肥胖，研究证明肥胖与2型糖尿病、心血管疾病甚至恶性肿瘤有一定的相关性，肥胖已成为一个全球性的健康问题。肥胖的标志就是脂肪细胞体积的增大或细胞数目的增加，因此寻找肥胖的分子生物学机制对于治疗或控制肥胖至关重要。研究表明非蛋白编码的microRNA作为转录后调节基因参与脂肪细胞的形成过程[5]，在肥胖及与之相关的胰岛素抵抗和2型糖尿病的病理生理过程中发挥着重要的调节作用。胰岛素信号转导缺陷是最常见的最早的导致个体发展为2型糖尿病的众多缺陷之一，microRNA已经被认定为是一类新的影响许多生物功能的调节分子，包括代谢过程[6-7]。然而，通过microRNA直接调节胰岛素敏感性在体内还没有被证实[8]。瑞士联邦理工学院分子生理学者Markus Stoffel和他的同事们进行了基因表达分析，发现microRNA 103和107在患有脂肪肝病的老鼠和人类体内都上调表达，而脂肪肝病是胰岛素抗性和糖尿病的先兆，microRNA导致胰岛素抗性，Stoffel等使用一种病毒载体在健康老鼠体内表达这两种microRNA，结果它们很快产生高血糖症状，通过喂食高脂肪食物变胖，并在这肥胖老鼠体内沉默这两种microRNA的表达，结果都显示这两组老鼠肝细胞和脂肪细胞中葡萄糖代谢得到了改善[9-10]。 研究人员们随后通过基因表达实验确定出这两种microRNA通过关闭脂肪细胞中小窝蛋白-1(caveolin 1)能稳定胰岛素受体的膜蛋白表达来降低胰岛素敏感性[10]。

用高脂、高能量摄食诱导的肥胖动物模型符合人类发病过程，是研究人类肥胖的理想动物模型，目前暂无报道采用芯片来筛查肥胖大鼠脂肪组织中差异表达的microRNA。microRNA在许多疾病过程的研究虽然刚刚起步却立即成为热点，然而，还有许多问题亟待解决。microRNA越来越被认定可以作为一种新的调节分子从而影响多种生物学功能，但是并没有很多的证据表明在肥胖及与之相关的胰岛素敏感性甚至2型糖尿病、冠心病方面有直接的调节作用[11-13]。本研究旨在建立高脂饮食诱导的大鼠肥胖模型，观察高脂饮食组与普通饮食组脂肪细胞的形态变化，对两组大鼠体质量、体长、网膜脂肪重量及血脂水平进行比较，在饲养第8周两组比较差异有统计学意义，通过microRNA芯片对468个microRNA分析，发现和普通饮食组相比，高脂饮食组大鼠差异表达的microRNA共有13个，其中上调7个，下调6个。本研究通过microarrayRNA印迹芯片技术筛查肥胖大鼠网膜脂肪组织中差异表达的microRNA，寻找肥胖诱发脂类代谢紊乱相关的microRNA，并通过Real-Time PCR验证，最终找到目的基因；从而了解调控脂肪细胞的生长的机制，初步探讨microRNA在肥胖大鼠中的作用，为进一步研究microRNA在诱发脂类代谢紊乱的相关分子机制奠定基础。

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(本文编辑郭怀印)

浦东新区科技发展基金创新资金资助项目(No.PKJ2012-Y16)

上海浦东新区人民医院(上海 021200)

张代富，E-mail：zhicuiju6@sina.com

R329

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.011

1672-1349(2017)01-0040-04

2016-04-05)

引用信息：支翠菊，黄瑛，祁炜罡，等.microRNA在肥胖大鼠脂肪组织中的差异表达[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(1)：40-43.