罗格列酮对OLETF大鼠肝脏组织病理变化及白细胞介素-17、Bcl-xl表达的影响

王会敏 梁 玉

(天津医科大学组织胚胎学教研室，天津 300070)

罗格列酮对OLETF大鼠肝脏组织病理变化及白细胞介素-17、Bcl-xl表达的影响

王会敏 梁 玉

(天津医科大学组织胚胎学教研室，天津 300070)

目的 探讨罗格列酮(RGZ)对2型糖尿病(T2DM)OLETF大鼠肝脏组织病理变化及白细胞介素(IL)-17、Bcl-xl的影响。 方法 取OLETF雄性T2DM大鼠16只，随机分为T2DM组和RGZ组，正常对照组(NC)组为LETO鼠，每组8只。给药12 w后同时采集肝脏组织，进行HE、Mass、PAS染色观察组织学改变，免疫组织化学染色观察IL-17和Bcl-xl阳性细胞。结果 T2DM组大鼠肝小叶结构紊乱，可见大量胶原纤维。肝细胞脂肪空泡形成、糖原沉积减少、细胞凋亡增加，Bcl-xl蛋白表达降低、炎症因子IL-17增加。RGZ组较T2DM组肝细胞损伤明显减轻。结论 T2DM可致肝脏组织学发生损伤，而罗格列酮可减轻这种损伤的发生。

2型糖尿病；肝脏；罗格列酮；Bcl-xl；白细胞介素-17

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一类由配体激活的核转录因子，属Ⅱ型核受体超家族成员，在参与调节细胞生长、分化及脂质代谢方面发挥重要作用。罗格列酮(RGZ)是一种噻唑烷二酮类药物，它通过激活PPARγ而增强胰岛素的敏感性，还能纠正代谢综合征，抗氧化应激，抗炎症反应。相比较于二甲双胍等抗2型糖尿病罗格列酮药物，使得心脏病的发作风险增加，但吡格列酮没有〔1〕。Zhi等〔2〕RGZ研究结果显示RGZ治疗与女性骨折风险呈正相关，且与年龄无关，但与其使用时间长短的关系不太确定。本实验通过研究自发性T2DM OLETF大鼠及其同系非糖尿病LETO鼠，通过一系列组织形态学的观察以及免疫组织化学染色炎症因子白细胞介素(IL)-17和抗细胞凋亡抗体Bcl-xl的变化来观察糖尿病肝脏的改变，探讨RGZ对T2DM OLETF大鼠肝脏损害的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 引进日本大冢制药株式会社德岛研究所24只OLETF鼠及8只同系非糖尿病LETO对照鼠作为研究对象，皆为雄性鼠，4周龄，建立T2DM模型。OLETF大鼠较LETO肥胖、活动迟缓、懒动、精神萎靡、少动闭眼、弓背蜷缩、喜扎堆、畏寒喜暖、毛色干枯无光泽。

1.2 试剂与仪器 马来酸罗格列酮为葛兰素史克(天津)有限公司生产，批号为08030115。抗IL-17、Bcl-xl单克隆抗体为Santa Cruz公司生产，SP免疫组化试剂盒由美国ZYMED公司提供。荧光分析系统购自美国Promega公司。胶原蛋白标准品和羟脯氨酸标准品由Sigma公司生产。

1.3 方法

1.3.1 T2DM大鼠模型建立及分组 大鼠在无特定病原体(SPF)级条件下单笼饲养，饲以标准饲料，12/12 h光照黑暗循环，自由获取食物和饮水。定期行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)检测血糖，按2 g/kg予30%葡萄糖溶液灌胃，于空腹及糖负荷后30、60、90和120 min取血，以德国内卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析仪测定血。糖值以血糖峰值>16.7 mmol/L和负荷后120 min血糖>11.1mmol/L诊为糖尿病，只具备上述1条件为糖耐量减低。至30 w时，共有成模OLETF大鼠16只，随机分为T2DM对照(T2DM)组、RGZ组(每组8只)，LETO为正常(NC)组。RGZ组：罗格列酮以蒸馏水溶解稀释，给药剂量为3 mg·kg-1·d-1。T2DM组与NC组以等量蒸馏水灌胃，各组均灌胃给药12 w，1次/d。

1.3.2 标本采集 三组大鼠同时处死，分别取肝脏组织。动物于股动脉放血后脱颈处死。以无菌器械迅速取肝脏2块，1块放入DEPC处理过的冻存管中，丢入液氮保存备用，1块置于10%的福尔马林中，行石蜡包埋切片。

1.4 观察指标

1.4.1 肝脏组织学观察 将石蜡标本制成5 μm的切片，HE染色后对肝脏的结构进行组织学观察。

1.4.2 胶原纤维的观察 石蜡标本制成切片后，进行Masson三色染色，观察各组胶原纤维的变化。

1.4.3 羟脯氨酸法测胶原蛋白 用高效液相色谱仪，测定胶原中的羟脯氨酸。以羟脯氨酸标准品的质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，根据羟脯氨酸标准曲线求得胶原蛋白标准品中羟脯氨酸含量，之后测定每个样品中羟脯氨酸的含量，进而换算出每个样本胶原蛋白含量。

1.4.4 肝糖原的观察 石蜡标本制成切片后，进行过碘酸-雪夫(PAS)染色，观察各组肝糖原的累积。

1.4.5 肝脏组织IL-17的测定 利用抗IL-17单克隆抗体，按SP法进行免疫组化染色，步骤：①切片常规脱蜡入水；②3%过氧化氢灭火内源性酶；③热诱导修复抗原；④滴加血清封闭液；⑤加入一抗(1∶125)，4℃冰箱过夜；⑥加二抗37℃ 15 min；⑦滴加试剂S-A/HRP 37℃15 min；⑧滴加试剂DAB显色，水洗；⑨二甲苯透明，封片。以胞质和细胞外基质中出现棕黄色颗粒为阳性表达，以PBS代替一抗作为阴性对照。采用Motic Imgages Advanced3.2版图像分析软件观察和分析IL-17的阳性表达水平。

1.4.6 肝脏组织Bcl-xl的测定 步骤同上。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 HE染色光镜下不同组肝脏组织学观察 NC组大鼠肝小叶规则，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝细胞分界清，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀，无炎性细胞浸润。T2DM组可见肝细胞排列结构紊乱，肝细胞肿胀、体积较正常增大，细胞内有较多空泡形成，考虑为脂肪变性，严重者胞质疏松，呈渔网样改变，且存在小叶内与门管区较多炎性细胞浸润。RGZ组肝细胞结构尚清晰，肝索结构排列尚整齐，虽然也存在空泡和炎性细胞，但较T2DM组明显减少。

2.2 肝脏组织Masson染色观察 NC组大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐，蓝色着色偶见于管壁，仅极少量胶原组织沉积于中央静脉壁；T2DM组肝小叶失去正常结构，门管区胶原大量沉积，可见大量胶原纤维自中央静脉及门管区向周围延伸，RGZ组肝细胞的体积较糖尿病组减小，胞质内脂滴的数目明显减少，甚至消失，炎细胞明显减少，形成纤维间隔。见图1。

图1 各组肝脏Masson染色(×400)

2.3 羟脯氨酸测量胶原蛋白含量 高效液相色谱法测得每克肝脏组织中的胶原蛋白含量T2DM组〔(134.54±18.78)mg/g〕明显高于NC组〔(64.52±21.51)mg/g，P<0.01〕。RGZ组〔(91.59±10.75)mg/g〕低于T2DM组(P<0.01)。

2.4 肝脏PAS染色观察 NC组肝小叶结构完整，肝细胞分界清晰，肝糖原分布均匀密集，染色均一呈粉红色，定位于胞质。T2DM组可见大量的脂肪空泡，肝细胞肿胀，拥挤且肝糖原分布疏松，呈渔网状。RGZ组肝糖原较T2DM组密布，脂肪空泡减少。见图2。

2.5 肝脏组织IL-17测定 肝脏IL-17免疫组化染色结果与T2DM组表达水平(32.06±3.21)较NC组IL-17着色较少〔(1.79±0.45)，(P<0.01)〕，主要分布在肝血窦，偶有在肝细胞内可见。而T2DM组IL-17呈弥漫性着色，且着色较深。RGZ组(7.35±1.47)着色较T2DM组明显减少(P<0.01)，在部分肝细胞着色较多。见图3。

2.6 肝脏组织Bcl-xl免疫组化图像结果分析 肝脏组织Bcl-xl在T2DM组(24.19±4.41)阳性表达较NC组(61.63±6.46)明显降低(P<0.01)。Bcl-xl阳性染色在NC组肝脏分布较均匀，密致，以中央静脉为中心向周围发射状分布，在肝小叶间隙处较少，可能与血供有关。T2DM组分布较凌乱，可见大量的脂肪空泡，核固缩坏死细胞，Bcl-xl在脂肪空泡周围分布密集。RGZ组(36.91±4.82)较T2DM组稍有好转(P<0.01)，脂肪空泡减少，但其着色较NC组明显减少(P<0.05)。见图4。

图4 各组肝脏Bcl-xl表达(DAB，×400)

3 讨 论

有研究表明血糖含量高的小鼠肝脏载脂蛋白(APOM)水平明显降低，在细胞培养中高浓度的葡萄糖抑制APOM的表达，且APOM的表达与胰岛素抵抗相关，但是RGZ可以使得APOM表达增加，具有逆转作用〔3〕。另外Yang等〔4〕研究认为RGZ对细胞脂肪的改善是通过去乙酰化酶(Sirtuin)途径，Sirt被认为是葡萄糖和脂类代谢的传感器，RGZ通过对Sirt1或Sirt1/Sirt6途径的调节来改善脂肪变，使得脂肪细胞减少。然而，Yuan等〔5〕通过对间充质干细胞衍生的血管瘤的研究表明，PPARγ可以分为四个亚型，其中PPARγ2主要存在于脂肪细胞，RGZ可以促进PPARγ2的基因表达，从而促进脂肪细胞的形成。本实验表明RGZ可以抑制肝脏脂肪细胞的增生。

Luo等〔6〕研究发现RGZ通过P38信号途径调节转化生长因子(TGF)-β1从纤维细胞到成纤维细胞的转化，抵抗纤维化的作用，减弱瘢痕的形成。康谊等〔7〕通过研究发现PPARγ作为一种核转录因子可能通过TGF-β1途径调节肝纤维化进程，并且RGZ通过抑制胶原基因表达在动物体内发挥抗纤维化作用。在本研究中T2DM组肝小叶失去正常结构，门管区胶原大量沉积，可见大量胶原纤维自中央静脉及门管区向周围延伸，RGZ组肝脏胶原纤维的含量明显比T2DM组降低，而通过羟脯氨酸法测得胶原蛋白含量的实验也证实了这一理论。

本研究发现T2DM持续性高血糖毒性导致细胞凋亡增加，Bcl-xl抗体减少，进一步加重了细胞的凋亡。另外，T2DM肝脏脂肪变也能促进细胞凋亡增加〔7〕。有报道指出用Tunel原位杂交的方法观察T2DM大鼠肝组织凋亡细胞，在正常组极少见肝细胞凋亡，T2DM组多出现蓝黑色的圆形凋亡细胞，而RGZ治疗组凋亡细胞明显减少〔8〕。IL-17是一种主要由活化的CD4+T细胞产生的致炎细胞因子，具有强大的免疫致病性，可以促进T细胞激活和刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞产生多种致炎因子，导致炎症的发生〔9〕。持续的高血糖可以增加炎症细胞的浸润，炎症介质的释放，从而进一步破坏肝细胞功能。但有研究表明当组织损伤时巨噬细胞会增多，但过多的巨噬细胞则可能会加重组织损伤，造成进一步的破坏并延迟修复。Das等〔10〕研究发现罗格列酮使得组织巨噬细胞增多。

对初发T2DM的患者来说，使用RGZ进行治疗能够有效地降低血糖水平及胰岛素抵抗指数，临床效果显著〔11〕。并且T2DM能够治疗非酒精性脂肪肝，通过改善组织对胰岛素的敏感性，改善患者胰岛素抵抗，调节血脂，从而减轻其肝损伤，疗效优于二甲双胍〔12〕。RGZ治疗血糖调节受损患者，在降低血糖的同时，可以改善红细胞变形能力，抑制机体炎症反应，进一步改善胰岛功能，预防T2DM并发症的发生〔13〕。

1 Breuing IM，Shaya FT,McPherson ML,etal.Development of heart failure in medicaid patients with type 2 diabetes treated with pioglitazone,rosiglitazone,or metformin 〔J〕.JMCP,2014;20(9):895-903.

2 Zhi ZN,Jiang YF,Ding T,etal.Risk of fracture with thiazolidinediones:an updated meta-analysis of randomized clinical trials〔J〕. Bone,2014;68:115-23.

3 Luo GH,Feng YH,Zhang J，etal.Rosiglitazone enhances apolipoprotein M (Apom) expression in rat′s liver〔J〕. Int J Med Sci,2014;11(10):1015-21.

4 Yang SJ,Choi JM,Chang E，etal.Sirt1 and sirt6 mediate beneficial effects of rosiglitazone on hepatic lipid accumulation〔J〕. PLoS One,2014;9(8):e105456.

5 Yuan SM,Guo Y,Zhou XJ,etal.Rosiglitazone accentuates the adipogenesis of hemangioma-derived mesenchymal stem cells induced by adipogenic media〔J〕. Original Article,2014;7(7):1741-6.

6 Luo YH,Ouyang PB,Tian J,etal.Rosiglitazone inhibits TGF-b 1 induced activation of human tenon fibroblasts via p38 signal pathway〔J〕. PLoS One,2014;9(8):e105796.

7 康 谊，曾艳丽，魏君锋，等.罗格列酮抑制大鼠肝纤维化机制研究〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志,2013;27(7):676-9.

8 Li Q,Zhou J.Effects of rosiglitazone on the liver morphology and adiponectin and NF-kBp65 of diabetic rats〔J〕.Hepatology,2006;44(12):27-33.

9 Kolls JK,Lindén A.Interleukin-17 family members and inflammation 〔J〕. Immunity,2004;21(7):467-76.

10 Das LM,Rosenjack JL,Au L,etal.Hyper-inflammation and skin destruction mediated by rosiglitazone activation of macrophages in IL-6 deficiency〔J〕. Invest Dermatol,2014;9(3):375-95.

11 QIN XH,Shi HM.Effect of Rosiglitazone and metformin on early-ontest type 2 diabetes,blood glucose and insulin resistance in patient 〔J〕. Modern Diag Treat,2013;24(17):3912-3.

12 Arab JP,Candia R,Zapata R.Management of nonalcoholic fatty liver disease:an evidence-based clinical practice review〔J〕.World J Gastroenterol,2014;20(34):12182-201.

13 刘 璠，冯红云，杨爱格，等.罗格列酮对糖调节受损患者红细胞变形能力及炎症因子的影响〔J〕.现代中西医结合杂志，2014；23(14)：1489-91.

〔2015-06-17修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

梁 玉(1960-)，女，硕士生导师，硕士，副教授，主要从事糖尿病研究。

王会敏(1988-)，女，在读硕士，主要从事糖尿病研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)01-0051-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.023