大豆异黄酮对家兔健康性能的影响试验

肖琛闻，金妙仁，刘 燕，韦 强，季权安，李 科，赵 剑，鲍国连*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；2.杭州启明星生物营养有限公司，浙江杭州 310021）

大豆异黄酮对家兔健康性能的影响试验

肖琛闻1，金妙仁2，刘 燕1，韦 强1，季权安1，李 科1，赵 剑1，鲍国连1*

（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；2.杭州启明星生物营养有限公司，浙江杭州 310021）

选用健康7周龄新西兰肉兔96只，分为4个处理组，每组24只，分别用4种含不同剂量大豆异黄酮的大豆蛋白饲料饲喂。在连续饲喂3周、5周后进行血清SOD活性、MDA含量测定，IgG和IgA水平测定，IL-4和IL-6测定，以及淋巴细胞增殖试验。结果大豆异黄酮可以显著提高家兔SOD水平，显著降低MDA水平和细胞免疫水平，提高细胞因子IL-4的表达，提高IgA水平，说明大豆异黄酮能够提高家兔免疫健康状态。

大豆异黄酮；家兔；健康性能

随着畜禽业的集约化发展，对饲料原料要求越来越高。大豆是重要的植物蛋白质和油脂来源，具有极高的营养价值，但是大豆中含有一些抗营养因子如血球凝集素、脲酶、胰蛋白酶抑制因子等，制约了其在畜禽饲料中的利用。但这些抗营养因子不耐热，挤压膨化处理后的全脂膨化大豆可通过淀粉糊化、蛋白质变性等途径破坏抗营养因子，提高大豆蛋白质的消化率。近年来，全脂膨化大豆作为高能、高蛋白饲料资源应用于畜禽饲料中，效果显著，可降低成本，提高效益。

与传统饲料生产模式相比，全脂膨化大豆具有更高的优越性，不仅使其添加油脂等工艺与设备复杂性的缺点得到改善，而且除了脂肪以外，还产生对动物营养有益的如脂质，包括磷脂等物质。大豆异黄酮（soybean isoflavones，SI）是一种从大豆中提取的具有弱雌激素作用的化合物，可以作为雌激素受体的激动剂或拮抗剂发挥作用，SI具有多种生物活性，能促进动物的生长，提高其繁殖性能，促进动物乳腺的发育，增加泌乳量，同时具有无毒性、无药物残留和添加剂量小等优点，与雌激素具有相同的性能而又完全符合畜产品安全生产的需要，极具作为新一代饲料添加剂的潜质［1］。本实验以大豆活性因子大豆异黄酮饲料为实验材料，以含膨化大豆成分的常规饲料为对比饲喂家兔，检测家兔的生长性能以及相关免疫指标，探讨含大豆异黄酮的膨化大豆饲料作为家兔生产的可行性，为生产实践中的应用提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品

大豆异黄酮（SI）购自上海迈瑞尔，编号486-66-8，膨化大豆由杭州启明星有限公司提供。SOD、MDA试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。IgG、IgA测定试剂盒，兔白介素-4（IL-4）、兔白介素-6（IL-6）购自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.2 试验日粮

全价日粮（不含抗生素和抗球虫药）由本所兔场提供。饲料配方为玉米12.00%、麸皮18.00%、膨化大豆8.00%、草粉30.67%、麦芽根10.00%、大糠16.00%、石粉0.83%、食盐0.50%、添加剂4.00%。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组和处理

选用健康7周龄新西兰肉兔96只，由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所试验兔场提供。将兔分为4个处理组，每组24只。分别用4种不同日粮饲喂，其中包括对照组、大豆异黄酮低剂量组（SI：0.001 5%）、中剂量组（SI：0.003 0%）和高剂量组（SI：0.006 0%）。分别在试验开始后第0天、第14天和第28天称量每个重复的兔子体质量和饲料消耗；在连续饲喂饲料3周、5周进行SOD、MDA测定、血清IL-4和IL-6测定；在连续饲喂饲料2周、5周进行IgG、IgA测定。在饲喂6周结束时进行活体质量和胴体质量测定。计算平均日增重、平均日采食量和饲料增重比。

1.2.2 血清SOD活性和MDA含量测定

试验开始后第3周、第5周每个试验组采6只兔子耳缘静脉血，凝固后1 500 g，离心10 min取血清。按试剂盒说明检测。

超氧化物歧化酶（SOD）测定。将血清用生理盐水稀释成不同浓度进行预实验，确定最佳稀释倍数。按试剂盒说明检测。

丙二醛（MDA）测定。按试剂盒说明检测。漩涡混匀器混匀，试管口用封口膜扎紧，用针刺一小孔，95℃水浴40 min，后取出流水冷却，然后1 500 g，离心10 min。去上清，532 nm处，1 cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度（D）值。血清MDA含量/（nmol·m L-1）=（测定管D-对照管D）/（标准管D-空白管D）×标准品浓度×样本稀释倍数。

1.2.3 血清IgG、IgA测定

在连续饲喂2周、5周结束时采集血液，分离血清。10×标本稀释液用蒸馏水1：10倍稀释。加样：每孔各加入标准品或待测样品100μL，将反应板充分混匀后置37℃，40 m in。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，在滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50μL（空白除外）。将反应板充分混匀后置37℃20 m in。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，在滤纸上印干。每孔加入酶标抗体工作液100μL，将反应板置37℃，10 min。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，在滤纸上印干。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗反应15 min。每孔加入终止液100μL混匀。30 min内用酶标仪450 nm处测吸光度值。

1.2.4 血清IL-4和IL-6测定

在连续饲喂3周、5周结束时采集血液，分离血清，测定细胞因子。标准品液配置。加样：每孔加入标准品或待测样品100μL，将反应板充分混匀后置37℃10 min。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4次，在滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50μL（空白除外）。将反应板充分混匀后置37℃20 m in。洗板：同前。每孔加酶标抗体工作液100μL。将反应板置37℃10 min。洗板：同前。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗处反应15 min。每孔加入100μL终止液混匀。30 min内用酶标仪在450 nm处测吸光值。

1.2.5 家兔淋巴细胞转化试验

在连续饲喂饲料3周后进行测定，同时取少量血液进行血液细胞分类测定。无菌心脏采集抗凝血，5 m L·只-1，加等量PBS稀释；取稀释好的9 m L血样轻轻加到3 m L淋巴细胞分离液上方（每管3 mL稀释后的血样），550 g，19℃，离心20 min；吸取中间云雾状白细胞层，加入2 mL PBS，550 g，4℃，20 min离心；弃上清，加PBS，550 g，4℃，20 min离心洗涤细胞2次；进行细胞数量的计数。弃上清，加入完全培养基RPM I1640（10%小牛血清）重悬细胞，将细胞浓度调整为1×106个· m L-1；将细胞加入24孔板，每孔0.5 m L，每孔再加入0.5 m L脂多糖（LPS）或刀豆素A（ConA），浓度分别为5μg·mL-1、12.5μg·mL-1。每个样品重复2孔，然后置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，在48 h以后，每孔取出200μL的细胞上清液，-20℃冻存备用（测细胞因子）。每孔加2 mg·m L-1的MTT 50μL，继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加酸化异丙醇150μL，用枪将细胞板孔内的MTT反复抽吸，使沉淀完全溶解，从24孔中，每孔取出100μL加入到96孔板上，在酶标仪检测D570值。

1.3 数据统计与分析

用SPSS 17.0软件进行数据统计和One-way ANOVA单因素方差分析，Tukey’s HSD方法进行组间多重比较和显著性检验，数据以平均值±标准差的形式表示。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 活体质量和胴体质量

从图1中可以看出，添加了大豆异黄酮的兔饲料能够显著提高家兔体质量和胴体质量。

2.2 血清中SOD活性和M DA含量

从图2中A可见，大豆异黄酮能够显著提高家兔SOD水平，在连续饲喂3周以后，中剂量组显著高于其他各组；在连续饲喂5周以后，高剂量组显著高于对照组和低剂量组。从图2中B可见，大豆异黄酮能够显著降低家兔MDA水平，在连续饲喂3周以后，各剂量组MDA含量均显著低于对照组；在连续饲喂5周以后，虽无显著性差异，但各剂量组仍能降低血清中MDA含量。

图1 家兔体质量和胴体质量

图2 家兔血清SOD活性（A）和MDA（B）含量

2.3 血清IgG、IgA水平

从图3中A可见，在饲喂大豆异黄酮2周或5周，血清中IgG水平各组之间无显著性差异。从图3中B可见，饲喂大豆异黄酮5周后，低剂量组IgA含量显著高于其余各组。虽然各组的IgG均与对照组无显著性差异，但是在连续饲喂5周以后，添加大豆异黄酮组IgG平均值均高于对照组。IgA在连续饲喂5周以后，低剂量组显著高于其余各组。

2.4 血清IL-4和IL-6

从图4中A可见，细胞因子IL-4在不同刺激物下，各组的刺激指数均有差异。其中在LPS刺激下，中剂量组的IL-4显著高于对照组；在ConA刺激下，高、中、低剂量组IL-4均显著高于对照组；在没有刺激物刺激下，中剂量组和高剂量组IL-4显著高于对照组。从图4中B可见，细胞因子IL-6在不同刺激物下，各组的刺激指数均无差异。但是高、中、低剂量组IL-6平均值均高于对照组。

图3 血清IgG（A）和IgA（B）水平

图4 家兔血清IL-4（A）和IL-6（B）含量

2.5 淋巴细胞转化试验

LPS主要是刺激B淋巴细胞增殖，B细胞在体液免疫反应中起主要作用，ConA主要是刺激T细胞增殖，T细胞主要在细胞免疫反应中起主要作用。从图5可见，高剂量大豆异黄酮能够显著提高家兔体液免疫（P＜0.05）和细胞免疫（P＜0.01）反应，说明大豆异黄酮能够显著提高提高家兔的免疫机能。

图5 家兔外周血淋巴细胞增殖指数

3 讨论

本研究得出，家兔日粮中添加大豆异黄酮，可以提高家兔的活体质量和胴体质量。大豆异黄酮（SI）主要活性成分有染料木黄酮（GEN），大豆黄素（DAI），黄豆黄素（GLY）等，大部分与糖结合以糖苷形式存在。大豆异黄酮可发挥间接抗氧化作用抑制促氧化酶如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）的活性，增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）的活性等［2］。本研究中试验组的SOD显著提高，表明膨化大豆蛋白饲料中添加大豆异黄酮起到了上调SOD的效果。丙二醛（MDA）是膜脂质过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂质过氧化，损伤生物膜结构，主要是细胞质膜，使得细胞膜结构和功能上受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。本研究中各试验组血清MDA含量均显著低于对照组，说明大豆异黄酮能显著抑制机体MDA的产生，从而起到保护细胞的作用。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白的70%～75%，在疾病免疫中起重要作用。本研究中各试验组在饲喂大豆异黄酮饲料5周后，IgG平均值高于对照组，虽然无显著性差异，但仍能说明大豆异黄酮具有促进机体免疫功能的作用，是一种良好的植物性免疫促进剂［3］。分泌型IgA是机体黏膜局部抗感染的主要抗体。故又称黏膜局部抗体。在饲喂5周后，低剂量试验组IgA显著高于对照组，说明大豆异黄酮能够提高家兔体内黏膜局部抗体，保护家兔免受病原微生物特别是呼吸道黏膜或者消化道黏膜易感菌的侵染［4］。

IL-4的生物作用包括刺激和活化B细胞，促进体液免疫应答，刺激Th0细胞增殖并朝Th2型细胞分化以及促进IgE分泌型B细胞转化与增殖等，故对嗜酸性粒细胞有募集、趋化、浸润等作用［5］。IL-6是炎症起始阶段的一个重要致炎因子，它通过诱导多种细胞合成和分泌多种急性期蛋白，促进感染时PMN（中性粒细胞）产生、活化、促进B细胞增殖、分化及产生免疫球蛋白、促进T细胞增殖、分化等，在急性期炎症反应中扮演着十分重要的角色［6］。从结果分析，细胞因子IL-4在不同刺激物下，各组的刺激指数均有差异。其中在LPS刺激下，中剂量组的IL-4显著高于对照组；在ConA刺激下，高、中、低剂量组IL-4均显著高于对照组；在没有刺激物刺激下，中剂量组和高剂量组IL-4显著高于对照组。可见大豆异黄酮能够提高动物分泌IL-4的水平，从而达到提高动物免疫力的效果。各组IL-6均未显著高于对照组，说明大豆异黄酮并未对IL-6起显著提高的作用。淋巴细胞增殖试验结果表明，大豆异黄酮能够显著提高家兔T、B淋巴细胞反应水平，提高家兔免疫机能。

4 小结

大豆异黄酮能够可以提高家兔细胞免疫的水平，提高细胞因子表达，以及动物抗氧化能力的提高。大豆异黄酮能够为家兔健康养殖提供有力保障。

［1］ 李方方，朱涛涛，张勇，等.大豆异黄酮对哺乳母猪生产性能、血液生理生化指标和粪便微生物菌群的影响［J］.动物营养学报，2015，27（9）：2803-2810.

［2］ 王龙梓.大豆异黄酮抗氧化作用与脑缺血防治［J］.中国老年学杂志，2015（15）：4385-4386.

［3］ 王利华，王光，王丽云，等.大豆异黄酮对肉仔鸡免疫功能的影响［J］.山东畜牧兽医，2008，29（10）：9-10.

［4］ 张志军，冯霞，蒋娟，等.茯苓多糖对小鼠血清IgA、IgG和IgM生物合成水平的影响［J］.中国免疫学杂志，2013，29（11）：1213-1215.

［5］ 莫丽亚，邓永超，黄彩芝，等.维生素D与IL-4及IL-12因子在儿童喘息性疾病中的表达及意义［J］.实用预防医学，2015，22（9）：1053-1055.

［6］ 李昕，刘佳佳.IL-6对中性粒细胞在炎症中作用的影响［J］.国际免疫学杂志，2005，28（5）：277-280.

（责任编辑：卢福庄）

S829.1；S816.42

A

0528-9017（2017）01-0139-04

文献著录格式：肖琛闻，金妙人，刘燕，等.大豆异黄酮对家兔健康性能的影响试验［J］.浙江农业科学，2017，58（1）：139-142.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170145

2016-09-26

杭州市重大科技创新专项（20142012A34）

肖琛闻（1979-），浙江杭州人，副研究员，从事家畜疾病防控工作。

鲍国连，E-mail：baoguolian@163.com。