羊体外受精技术研究概况

豆兴堂

（辽宁省畜牧科学研究院， 辽宁 辽阳 111000）

羊体外受精技术研究概况

豆兴堂

（辽宁省畜牧科学研究院， 辽宁 辽阳 111000）

本文较系统地总结了羊体外受精技术研究状况，包括卵母细胞体外成熟、体外受精等技术环节，并提出了需要解决的技术问题。

羊；卵母细胞；精子；体外受精；胚胎

近年来，我国山羊饲养业发展迅速，但也存在一些问题，主要表现在山羊良种化程度不高、世代间隔较长、遗传改良速度较慢。优良种公、母羊数量少难以满足大量低产山羊的改良需求，而一些生物技术如母羔超排、体外受精、胚胎移植等技术可以最大限度地发挥具有优秀生产性能的种公、母羊遗传资源，满足我国养羊业对良种的巨大需求。因此研究解决羊体外受精等重要相关技术瓶颈就成为迫切任务之一。

哺乳动物体外受精研究已经有几十年的历史，已相继在130余种哺乳动物上获得成功[1]。1985年Hanada等[2]在世界上首次实现山羊体外受精。1990年我国钱菊汾等[3]成功获得一只“试管山羊”。1996年刘东军等[4]经体外受精胚胎移植得到了“试管山羊”。2004年王公金[5]等经过胚胎移植成功产下了“试管山羊”。成国祥等[6]用超排山羊卵巢排卵后第1天的98枚卵巢卵母细胞，体外成熟体外受精卵裂率为21.43%，21枚2细胞胚移植5头受体，获2只羔羊。大量研究证明，经体外受精技术生产的胚胎，通过胚胎移植给代孕受体羊完全可以正常生产羔羊。

1 卵母细胞获取与体外成熟

1.1 卵母细胞的获取方法

主要有离体采集和活体采集。离体采集利用卵母细胞数有限，不可重复使用，且其种质一般都相对较差。活体采集能获得大量种质优良山羊的卵母细胞用于体外受精生产胚胎，可反复进行且对供体山羊的生产性能和生殖机能无不良影响。因此，活体采卵技术成为体外受精一项关键技术。

活体采卵有手术法、B型超声波法和腹腔镜法。手术法采集卵母细胞操作简便，容易观察卵巢情况，回收率较高。许杰等[7]研究表明，抽吸法得到的平均卵母细胞数最多，刺破法较为适合回收山羊的卵巢卵母细胞。

腹腔镜法随着体外胚胎生产技术的发展，近些年逐渐得到应用。Berlinguera等[8]报道了LOPU采集卵母细胞的操作方法，可以参照操作。Graft等[9]认为，腹腔镜活体采卵技术容易观察卵泡，在抽卵时可以对卵巢频繁地进行冲洗，可能会减少粘连的发生。

B型超声波法。1987年Callesen等[10]首先报道了B超应用于卵母细胞采集。Graft等[9]报道了此技术在羊上的具体操作方法，但可见卵泡数较少，最终获卵数也较少。

1.2 卵母细胞体外成熟培养

1.2.1 卵母细胞成熟

卵母细胞的成熟被称为卵母细胞获能。该过程包括恢复减数分裂并进入到第2次减数分裂中期（MⅡ）的核成熟和经历一系列复杂生理生化变化的细胞质成熟[3]。卵母细胞成熟过程中细胞核发生生发泡破裂（germinal vesicle breakdow，GVBD）、染色质浓缩和排出第1极体等一系列形态学的变化，当减数分裂完成时，标志着卵母细胞核的成熟。人工采集的卵母细胞大都完成了生长，进入成熟期，其经历了第2次减数分裂间期而达到中期（MⅡ）[2]。卵母细胞体外成熟是以卵丘细胞扩张、第1极体排出作为形态上的标志。卵母细胞减数分裂的恢复是以 GVBD 为判断标准的，第1极体的排放是卵母细胞成熟的标志[11]。

1.2.2 卵母细胞成熟培养主要因素

1.2.2.1 基础培养液

卵母细胞体外成熟基础液有TCM199、Ham’s F-12、Menezo’s B2、NUSC23和MEM等，以TCM199应用最为广泛。刘灵等[12]研究表明，TCM199和Ham’s F-12都是山羊卵母细胞体外成熟合适的培养基。林峰等[13]以TCM199为基础培养液，添加10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG和FCS等体外成熟培养卵母细胞，结果15% FCS组卵母细胞成熟率为67 %。

1.2.2.2 培养环境条件系统

温度对卵母细胞体外成熟培养有很大影响。研究表明，一般家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用38～39℃，5% CO2空气、饱和湿度[14]。气相环境中的CO2浓度由于目前培养液中NaHCO3浓度多为25～30 mmol/L，故一般都采用5%的CO2。另有气相环境为：5%CO2、5%O2、90%N2。但Azambujaa等[15]研究结果表明，5%CO2、5%O2、90%N2下成熟培养的卵母细胞，桑椹胚和囊胚发育率明显低于含5%CO2的空气。一般采用微滴培养和四孔板培养。

1.2.2.3 激素

卵母细胞成熟培养中常用的激素有FSH、LH、E2等。王海滨等[16]研究认为，体外培养卵母细胞时必须添加FSH，FSH维持颗粒细胞和卵母细胞间的联系，有利于卵母细胞发育成熟。Kobayashi等[17]研究结果表明，LH或hCG可以诱导卵母细胞成熟分裂能力的恢复。Zuelke等[18]证实，在无血清时LH用于体外培养卵母细胞成熟，能提高卵母细胞成熟后的胚胎发育能力。雌二醇（E2）可促进卵母细胞在体外成熟过程中受精和胚胎发育。刘灵等[12]研究表明，卵母细胞成熟培养液中添加1 μg/mL E2，成熟率（79.4 %）显著高于对照组（55.6 %），说明成熟液添加E2对其成熟是有益的。因此E2目前被广泛用于卵母细胞的体外成熟培养。

1.2.2.4 血清

卵母细胞体外成熟液通常都添加血清。常用的血清有FCS、OCS和SS，众多研究结果表明，以FCS效果最好。Sanbusissho和Threlfall[19]比较了不同发情阶段母牛血清，结果表明，发情盛期的母牛血清要优于其他发情周期阶段的血清。张涌等[20]研究结果表明，卵母细胞体外成熟同种动物的血清要优于异种动物血清。血清成分较为复杂，效果不够稳定，因此近年开展许多血清替代物研究，可能是卵母细胞体外成熟培养一种方向。

1.2.2.5 生长因子

EGF是一种单链的多肽，对颗粒细胞等多种细胞具有促进分裂的作用。王艾平等[21]研究结果表明，EGF对山羊COCs体外成熟和卵裂发育具有明显的促进作用，成熟液中EGF优选浓度为50 μg/mL，COCs成熟率(75.45 %～75.18 %)和卵裂率(72.4%～74.1%)均显著高于其它组。刘丑生等[22]研究EGF对绵羊卵母细胞成熟及卵裂的影响表明，50 μg/mL的EGF的成熟率和卵裂率分别为71.2%和45.5%，显著高于对照组与其他组；当EGF浓度达到100 μg/mL时成熟率和卵裂率最高，分别为72.9 %和45.7 %。羊卵母细胞成熟液中的常用量为10～50 ng/mL。

1.2.2.6 其他

卵母细胞体外成熟培养时间，山羊一般为24～26 h，不同动物其培养时间不同。刘灵等[12]研究表明，山羊卵母细胞成熟24 h、25 h和26 h，成熟率为（78.3 %、80.0 %和80.6 %）没有差异。李颖等[23]研究了结果表明，山羊卵母细胞体外成熟培养20 h、22 h、24 h,成熟率显著高于培养18 h、26 h、,30 h（P<0.05）。王超[24]研究显示，山羊卵母细胞37℃ 下的成熟率显著低于38.5℃、39.0℃下的成熟率，培养24 h和培养26 h的成熟率极显著高于培养18 h和20 h。卵母细胞的成熟潜力还与采卵季节相关，繁殖季节获取的卵母细胞成熟率较高。

2 精子获能与体外受精

2.1 精子获能

精子体外获能处理是体外受精技术的重要环节。Austin发现并定义了哺乳动物精子获能（Capacitation）现象。现已弄清精子在体内的获能过程如下：哺乳动物生殖道内的获能因子中和精子表面的去能因子，并促使精子质膜的胆固醇外流，导致膜的通透性增加。而后Ca2+进入精子内部，激活腺苷酸环化酶，抑制磷酸二酯酶，诱发cAMP的浓度升高，进而导致膜蛋白重新分布，膜的稳定性进一步下降，精子的获能即完成[3]。因此，可以通过脱除精子被膜蛋白，增加通透性和Ca2+内流的处理方法诱发精子获能。

2.2 精子获能处理方法

精子体外获能方法可分为两步，首先是精子洗涤，筛选活精子；其次进行精子获能处理。

精子经一次或多次离心后除去杂质、死精子、冻精保护液及稀释液等，从而筛选活力好的精子。悬浮法是筛选高活力精子最为有效的一种方法。Parrish等[25]首次采用悬浮法分离牛的精子进行体外受精，结果表明，可使受精率由46%提高到59%。Purvis和Egdetveit[26]研究表明，如将悬浮的试管倾斜30°，则能提高精子的可利用数量50 %～100 %。山羊多用mDM液和不含BSA的BO液。

其次进行精子的获能处理。主要使用钙离子载体、肝素和BSA等，以促使Ca2+进入精子顶体，并刺激精子内部pH升高，从而诱发精子获能。

钙离子载体A23187获能处理。马恒东等[27]研究表明，钙离子载体的添加量在0.3 μmol/L时，利用去透明带金黄地鼠卵穿卵试验，穿透率达到68.2%；咖啡因与肝素、钙离子载体具有明显的协同作用。将获能的精子与山羊卵母细胞进行体外受精孵育17 h，也获得了60%以上的受精率。叶华虎等[28]比较不同获能诱导剂对山羊精子体外获能及受精能力的影响，结果表明，0.1 μmol/L， 0.4 μmol/L，0.7 μmol/L IA均能提高精子获能率，其中0.4 μmol/L处理组精子获能率最高为56.2%；IA组的卵裂率明显高于肝素组(P<0.05)，IA表现出更强的促卵裂发生效果。

肝素获能处理。大多数研究者体外受精中肝素的浓度为10～50 μg/mL。钱红娟等[29]认为，用肝素诱导山羊精子体外获能10 Lg/mL的浓度最有利。吕丽华等[30]山羊卵母细胞体外受精的研究表明，肝素（50 μg/mL）组和钙离子载体（0.1 μmol/mL）组受精率分别为56.0%和67.0%，显著高于咖啡因（10 mmol/L）组的21.0%；肝素组卵裂率（51.1%）显著高于钙离子载体组（36.3%）和咖啡因组（19.0%）；囊胚率肝素组（17.8%）与钙离子载体组（11.7%）差异不显著，表明肝素处理精子获能受精比较稳定。

精子获能检测。近年来，Moller[31]和Aarons[32,33]等报道采用考马斯亮蓝（CBB）染色法来检测小鼠精子顶体反应。CBB G250是常用的蛋白染料，它对顶体膜或顶体内含物具有特异亲和性。AR发生后，顶体内的蛋白酶流失，CBB G250结合量明显减低，因而顶体着色较淡。反之，未发生AR的精子，顶体着色较深。江一平等[34]通过用3.5%高氯酸水溶液配制0.05%考马斯亮蓝(R250)染色液浸染人精子30 min，顶体完整者顶体区染成紫蓝色，顶体反应者则不染。建立了一种检测人精子顶体反应的简便实用新技术，方法学检验证明新技术结果可靠。卓丹心等[35]在先前报道[32]基础上，将CBB液加以改良建立了一种哺乳动物精子AR检测较通用简便的技术。研究结果表明，经CBB染色后，头部呈现出两种类型染色特征———A型和B型。A型未获能精子顶体区成紫蓝色，顶体后区浅紫色；B型获能精子顶体区不染色或染浅紫色，顶体后区与A型相似。经方法学实验表明，CBB染色批内变异系数低，说明可重复性好，结果可靠，可用于AR的检测实验。叶华虎等[36]的研究证实，考马斯亮蓝（CBB）染色技术可用于哺乳动物精子顶体状态的准确评价。陆海一等[37]也验证了CBB染色技术可作为检测人精子形态和顶体反应的可靠而实用的方法。与传统的瑞-吉染色法相比，CBB-G250染色法不仅操作简单、试剂配制方便，而且染色时间较短、不受染液pH的影响。

2.3 精子与卵母细胞体外受精方法

2.3.1 体外受精系统

卵母细胞体外受精培养系统主要有微滴法和四孔培养板法。微滴法是一种应用最广的培养系统。该法的优点是受精液及精液的用量均较少，体外受精的效果亦较好。四孔板培养法是采用四孔板为体外受精器皿，每孔加入500 μL受精液和100～150枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子，在培养箱中孵育20～24 h。该法的优点是操作相对比较简单，受精结果不受石蜡油质量的影响。精卵体外受精一般在38.5℃、5%CO2的空气、饱和湿度下进行。

2.3.2 受精体系

用于体外受精的基础液通常为SOF液、TALP液和BO液，主要成分为无机盐离子，不含复杂的氨基酸和维生素等成分。张锁链等[38]用BO液将精液稀释、离心洗涤后，用含有20 mg/ mL BSA(Sigma)和5 mg/mL肝素调整精子密度为（20～30）×106个/mL，用精子悬浮液做成微小滴，将成熟培养后的卵母细胞移入该微小滴中进行受精处理6 h后，将卵子移入以TCM199为基础液的发育用培养液中继续进行培养，卵裂率为40%～49.6%，囊胚率为15.8%～18.8%。刘新峰等[39]对不同受精液对山羊卵母细胞体外受精的影响进行了研究。结果表明，BO液的受精率（62.2%）显著高于TCM199液（44.7%），且卵裂率（21.6%）显著高于TALP液（9.1%），极显著高于TCM199（0.0%）。武建朝[40]对比了BO液和TALP液受精结果，表明TALP受精液受精率和卵裂率显著高于BO液（55.88% : 33.33%，42.11% : 30.00%），但桑堪胚、囊胚率差异不显著。说明TALP液比BO液更适合性成熟前山羊卵母细胞的体外受精。近年来，出现了将SOF液用于体外受精的受精液。陈晓勇[41]以SOF液为基础液，比较了羔山羊卵母细胞与成年山羊卵母细胞体外受精与胚胎发育能力，结果显示，羔羊卵母细胞在卵裂率（59.0%）和桑椹胚率（17.4%）方面都极显著性低于成年羊卵裂率（82.4%）和桑椹胚率（46.4%）。

2.3.3 精卵作用时间

精卵作用时间对体外受精的效果非常重要，过短不足以保证受精率，过长又容易引起多精入卵。同时精卵孵育时间也受受精液中辅助获能物质的影响。精卵孵育作用时间也依受精液而不同，BO受精液[42]精卵作用6～8 h，TALP受精液精卵作用18～20 h，SOF受精液精卵作用22～24 h。

2.3.4 其他

体外受精效果还受精卵比率、温度、水质等因素的影响。精子浓度若过高易引起多精入卵，若过低又影响受精率，通常适宜体外受精的精子浓度为（1.0～1.5）×106个/mL，精卵比率为10 000～20 000∶1。温度对体外受精效果有很大影响。戴荣亮[11]研究结果显示，在37℃、38℃和39℃下，卵母细胞成熟率及其受精率差异不显著，但39℃下的受精率（14.7%）高于 38℃（13.4%）和 40℃（12.8%）受精率。水质是体外受精的一个重要影响因素，对体外受精的成功与否至关重要。水质量对IVF有明显影响，配制受精液的水应该为超纯水，是通过离子交换柱去除水中杂质和离子，水在配制前应经过高温高压灭菌。陈晓勇等[43]研究表明，小尾寒羊胚胎发育液中添加10 μmol/L EDTA，16细胞以上胚胎率（100%）极显著高于对照组（46.97%）。

3 早期胚胎体外发育培养

体外受精的早期胚胎发育存在阻断现象，并不是都能发育至囊胚阶段。近些年，通过改善体外培养条件，胚胎体外发育的能力有所提高。体外受精胚胎体外培养液主要有：复杂的培养液（TCM199等）和成分明确的培养液（SOF、CR1等）。基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物、抗生素、能量底物和蛋白质等。吕丽华[44]研究山羊胚胎体外培养结果表明，颗粒细胞和输卵管上皮细胞共培养胚胎条件下，体外受精胚胎的卵裂率分别为 46.3%和40.8%，显著高于无共培养体系组 28.1%；发育到 8～16细胞的胚胎比率分别为 49.1%和45.0%，极显著高于无共培养组 5.7%；囊胚数比率分别为 17.6%、20.0%，极显著高于对照组；前48 h SOF+BSA后48 h SOF+FCS胚胎培养液更能促进胚胎发育（囊胚率34.7%）。王艾平等[21]向胚胎培养液中添加亚硫磺酸(HTAU) 研究其对山羊体外胚胎发育的影响，结果显示，亚硫磺酸有益于早期胚胎的体外发育，胚胎培养液中HTAU的优选浓度为0.5 mmol/L。张家新等[45]比较了非必需氨基酸（NEAA）、必需氨基酸（EAA）对绵羊体外胚胎的发育。结果表明，胚胎培养液单独添加NEAA可明显提高绵羊胚胎的囊胚发育率；单独添加EAA对绵羊桑椹期前的胚胎发育没有促进作用，但可以促进囊胚孵化；0.5×EAA+1×NEAA组合的囊胚率和囊胚孵化率最高，分别为44%和33%。武建朝[40]比较了性成熟前山羊受精卵CR1aa和SOFaa胚胎发育体系，结果表明SOFaa培养系统的卵裂率和桑椹胚囊胚率显著高于CR1aa培养系统（42% :35.56%，12% : 5.71%）。试验研究发现，通过改进胚胎培养液、培养方法，已大幅提高了胚胎体外发育能力。

4 结语

经过科研人员大量的试验研究，目前体外受精率有所提高，但对部分卵母细胞和早期胚胎的发育调节机理不是很清楚，卵母细胞核质成熟是否真正成熟，其影响到受精和胚胎的发育；精卵受精过程中，不正常受精情况；受精卵发育阻断及胚胎持续发育能力等都是制约体外受精技术真正实现推广应用的瓶颈。总之，山羊IVF技术研究已经取得了重大的进步，还需进一步深入研究IVM、精子处理、IVF、IVC等相关技术环节，明确其互相影响机制，优化集成技术，才能使其真正走向养殖业的推广应用领域。

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S814.3；S826.3

B

1005-2739（2017）01-0007-07

2016-11-03

豆兴堂（1978-），男，硕士，高级

畜牧师，主要从事绒山羊繁殖育种与胚胎工程技术研究与推广工作。E-mail：dou791120@sina.com