多壁碳纳米管分散型固相萃取-高效液相色谱测定降糖保健食品中非法添加药物罗格列酮

黄佳佳,江东文,杨 昭,李燕杰,徐振林

(1.广东食品药品职业学院,广东广州 510520;2.广州市食品药品监督管理局审评认证中心,广东广州 510410;3.华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

多壁碳纳米管分散型固相萃取-高效液相色谱测定降糖保健食品中非法添加药物罗格列酮

黄佳佳1,江东文2,杨 昭1,李燕杰1,徐振林3,*

(1.广东食品药品职业学院,广东广州 510520;2.广州市食品药品监督管理局审评认证中心,广东广州 510410;3.华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

本文建立多壁碳纳米管分散型固相萃取-高效液相色谱法测定降糖类保健食品中非法添加物罗格列酮的检测方法,重点考察了样品提取溶剂和提取时间、净化剂类型、组成、使用量和净化时间对回收率的影响。结果表明,样品前处理最优条件为:采用无水甲醇超声提取20 min,经多壁碳纳米管(MWCNTs)和N-丙基乙二胺(PSA)净化1 min。所建立的高效液相色谱法测定降糖类保健食品中罗格列酮的线性范围为1.0～50.0 μg/mL,相关系数为0.9997,检出限和定量限分别是0.02 μg/mL和0.06 μg/mL。样品加标平均回收率为77.3%～93.2%,相对标准偏差(RSD)小于10%。该样品前处理方法简便、快速且成本较低,适用于批量保健食品中罗格列酮的快速检测。

多壁碳纳米管,分散型固相萃取,保健食品,罗格列酮,高效液相色谱

我国有数量较多的糖尿病、糖耐量异常人群,降糖药物和相应保健食品需求量大,一些不法商贩在利益驱动下,为增强产品功效,在降糖类保健食品中非法掺入疗效确切、价格低廉的降糖类药物。罗格列酮是一种口服抗高血糖药物,能增强机体对胰岛素的敏感性,控制血糖的生成、转运和利用[1]。由于降糖效果明显,作用强度大,也是目前市面上声称辅助降糖类保健食品中常见的违法添加的降糖西药之一[2-3]。消费者不知情而长期服用非法掺入罗格列酮的保健食品,会引起一些毒副作用,如心血管系统和肝脏的不良反应,严重者危及生命[4-5]。因此建立快速、准确、可靠的降糖类保健食品中非法添加药物罗格列酮的检测方法具有重要意义。

目前测定降糖保健食品中罗格列酮的方法主要有高效液相色谱法[6-9]和液相色谱-质谱联用法[10-12]。降糖类保健食品如胶囊、茶剂成分复杂,既有中药成分,部分也含茶叶,其中一些杂质(如色素)不仅会对色谱设备造成损害,而且会造成基质效应,干扰目标对象分析,导致样品回收率低,影响检测的准确性和灵敏度[13-14]。因此尽可能完全提取分析对象,同时除去共存的杂质,减少干扰物质,实现分析对象分离富集和基质净化,是检测复杂基质中罗格列酮样品前处理方法的关键。

多壁碳纳米管分散型固相萃取(MWCNTs-dSPE)是近几年发展的样品前处理方法。其中多壁碳纳米管(MWCNTs)是一种新型吸附材料,具有化学性质稳定、萃取效率高、成本低和可重复利用等方面的优点[15]。因其比表面积大,具有快速吸附色素等杂质的能力[16-17],目前已有研究将其作为净化剂应用于蔬菜、水果及茶叶农药残留检测的样品前处理中[18-21]。相比较传统固相萃取SPE,分散型固相萃取(dSPE)无需填充柱子和严格控制上样及洗脱过程,而是直接将吸附材料加入含有目标分析对象的样品提取液中,在杂质吸附模式下,吸附材料保留样品中的杂质,从而实现样品基质的净化[22]。MWCNTs-dSPE法快速简便,其作为样品前处理方法应用于食品安全检测领域的研究正迅速开展[23-25]。本实验建立了基于MWCNTs-dSPE的高效液相色谱测定保健食品中非法添加药物罗格列酮的方法,对于快速筛查保健食品中罗格列酮的残留及保障保健食品质量安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多壁碳纳米管吸附剂(MWCNTs外径10～20、20～40、40～60 nm) 购于深圳纳米港公司;N-丙基乙二胺(PSA) 购于博纳艾杰尔有限公司;盐酸罗格列酮标准品 购于中国食品药品检定研究所;无水甲醇、乙腈 均为色谱纯;乙酸铵 分析纯;苦荞茶、降糖茶、降糖胶囊 均为市售。

LC-20AT高效液相色谱仪(配有SPD-M20A二极管阵列检测器,DGU-20A5R在线脱气机,LC-solution工作站) 日本岛津公司;MX-S 涡旋混合器 上海大龙医疗器械有限公司;SY-800 数控超声波清洗器 上海宁商超声仪器有限公司;AUY 120电子天平 日本岛津公司;GL-21M高速离心机 湘仪离心机仪器公司;S220酸度计 瑞士梅特勒托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取罗格列酮标准品10.0 mg置于10 mL的棕色容量瓶中,用无水甲醇定容,配制成1.0 mg/mL的标准储备溶液,4 ℃避光保存。使用时,准确移取适量标准储备液进行稀释,配制1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的标准溶液,在优化的色谱条件下测定,以各物质的峰面积为纵坐标,溶液以质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.2 高效液相色谱分析条件 色谱柱:岛津InterSustain C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.01 mol/L(pH5.5)的乙酸铵溶液(体积比56∶44);检测波长:245 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:10 μL;柱温:30 ℃。

本实验比较流动相乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液和甲醇-0.01 mol/L乙酸铵溶液对目标色谱峰形和响应值的影响,同时考察pH5.5和pH6.0的乙酸铵溶液对改善色谱峰拖尾现象的效果。

1.2.3 罗格列酮的提取 以苦荞茶进行前期检测方法的优化实验,之后再将优化方法运用于其它样品的检测。具体过程如下:取罗格列酮添加浓度为50 μg/g的苦荞茶样品1.00 g于50 mL塑料离心管中,加入无水甲醇5 mL,涡旋混匀,室温下超声20 min(功率800 W,频率40 kHz),以6000 r/min离心10 min,移取上清液于干净的离心管中,待净化后进行高效液相色谱测定。

1.2.3.1 提取溶剂的选择 按1.2.3提取过程,考察不同提取溶剂对样品中罗格列酮回收率的影响。提取溶剂为无水甲醇和乙腈,其它提取条件不变。提取溶液待净化后进行高效液相色谱测定。

1.2.3.2 提取时间的选择 按1.2.3提取过程,考察不同超声时间对样品中罗格列酮回收率的影响。超声功率800 W,频率40 kHz,时间分别为10、20和30 min,其它提取条件不变。提取溶液待净化后进行高效液相色谱测定。

1.2.4 样品提取液净化 对样品提取液净化过程进行优化。分别考察净化剂外径、组成、用量及净化时间对样品中罗格列酮回收率的影响。具体过程如下:取上述提取液体3 mL于装有组合净化剂MWCNTs(10～20 nm,60 mg)和PSA(45 mg)的离心管中,涡旋混匀,振荡1 min。将离心管置于离心机内,10000 r/min离心10 min。移取上清液,经0.22 μm膜过滤,进行高效液相色谱测定。

1.2.4.1 净化剂的选择 考察单一净化剂和组合净化剂对样品基质净化效果。按1.2.4净化过程,3 mL样品提取液分别使用MWCNTs(10～20 nm,60 mg)、PSA(45 mg)及MWCNTs(60 mg)和PSA(45 mg)进行净化处理,其它净化条件不变。

对比不同外径MWCNTs对样品基质净化效果。按1.2.4净化过程,分别考察外径为10～20、20～40、40～60 nm的MWCNTs和PSA组合的净化效果,其它净化条件不变。

1.2.4.2 净化剂使用量的确定 考察不同用量的MWCNTs和PSA对样品基质净化效果和罗格列酮回收率的影响。按1.2.4净化过程,MWCNTs和PSA的使用量如表1所示,其它净化条件不变。

表1 MWCNTs和PSA用量Table 1 The dosage of MWCNTs and PSA

1.2.4.3 样品净化时间的选择 在净化剂使用量优化的条件下,考察净化剂作用时间对罗格列酮回收率的影响。按1.2.4净化过程,涡旋振荡时间分别为1、2、3和4 min,其它净化条件不变。

1.2.5 加标回收实验 苦荞茶、降糖茶、降糖胶囊三种空白样品(经HPLC确认)分别平行取18份,每份1.00 g,分别添加25、50、75 μg/g三种标准品浓度,每个浓度平行6次实验。按1.2.3和1.2.4步骤进行加标回收实验。

1.3 回收率计算

采用高效液相色谱检测,样品提取条件优化和加标回收分别采用平行3次和6次实验,使用excel软件计算样品中罗格列酮回收率,公式如下:

式(1)

式(2)

式中,C为经高效液相色谱测定所得罗格列酮样品提取液质量浓度,单位为μg/mL;V为提取液体积,单位为mL;M为样品质量,单位为g;C1为经高效液相色谱测定并计算所得样品中罗格列酮质量浓度,单位为μg/g;C2为罗格列酮理论添加质量浓度,单位为μg/g。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

流动相的组成、配比和pH会影响罗格列酮的色谱行为。实验结果表明,使用流动相体系为乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液时目标对象峰形好,响应值较甲醇-0.01 mol/L乙酸铵溶液高,pH5.5的乙酸铵溶液对改善色谱峰拖尾现象效果更好。因此,本实验采用乙腈-0.01 mol/L乙酸铵溶液(pH5.5)作为流动相,以体积比56∶44 混合,总流速为0.8 mL/min,在检测波长为245 nm条件下测定罗格列酮。

2.2 线性方程与检出限

按1.2.2的色谱条件进行分析,以峰面积对浓度绘制标准曲线,如图1所示,罗格列酮在1.0～50.0 μg/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.9997,以3倍和10倍信噪比(S/N)确定方法的检出限和定量限分别是0.02 μg/mL和0.06 μg/mL。

图1 罗格列酮标准曲线Fig.1 Standard calibration curve of Rosiglitazone

2.3 罗格列酮的提取

2.3.1 提取溶剂的优化 本实验对比无水甲醇和乙腈对样品中罗格列酮回收率的影响。如图2所示,无水甲醇更有利于样品中罗格列酮的提取。由于无水甲醇极性较乙腈大,对罗格列酮溶解性更好,所得样品回收率较乙腈高。故本实验采用无水甲醇溶液提取保健食品中的罗格列酮。

图2 提取溶剂的选择(n=3)Fig.2 The effect of extraction solvent(n=3)

2.3.2 提取时间的选择 提取时间影响检测对象的提取效率。用时较短无法实现目标物质的充分提取,用时过长不仅会导致溶剂的损失,同时样品中的杂质溶出量增加,影响检测的准确性。本实验对比了不同的超声时间对罗格列酮回收率的影响,结果表明,超声10 min以上样品回收率均可达到80%左右,如图3所示,为使得提取更充分,减小实验偏差,本实验选用20 min作为提取时间。

图3 提取时间的选择(n=3)Fig.3 The effect of extraction time(n=3)

2.4 样品提取液净化

2.4.1 净化剂的选择 保健食品基质复杂,既含中药成分,茶剂中还含部分茶叶,使得样品中不仅色素含量相对较高,同时还含有生物碱和多酚类成分。相关研究表明,MWCNTs主要是去除基质中的色素,PSA 有两个氨基,能去除茶叶基质中的有机酸、金属离子、多酚类物质和一部分极性较大的色素等[26]。针对基质相对复杂的样品,两种或两种以上的净化剂净化效果较单一吸附剂净化效果理想[27-28]。实验结果表明:对比无净化处理的样品,单独使用MWCNTs或PSA净化的样品颜色变浅,而使用MWCNTs和PSA结合净化样品的颜色最浅(图4所示)。色谱图(图5)中显示使用MWCNTs和PSA结合净化的样品较未经净化和单独使用MWCNTs净化的样品在杂质峰数量均减少,响应值下降,而对检测对象罗格列酮影响小。

图4 不同净化剂处理的降糖茶提取液Fig.4 Hypoglycemic tea extract with different purifying agent注:A：未净化;B：MWCNTs和PSA净化;C：仅MWCNTs净化;D：仅PSA净化。

图5 无净化和经净化处理加标苦荞茶色谱图Fig.5 The chromatogram of buckwheat tea with standard before and after purification 注:A：无净化;B：经MWCNTs净化;C：经MWCNTs和PSA净化。

此外,不同MWCNTs外径具有不同的比表面积,对样品的净化效果也有所差异[16]。本实验对比不同外径MWCNTs净化样品基质的效果,结果见图6,外径为10～20 nm(比表面积100～160 m2/g)的MWCNTs与PSA混合净化效果最好,杂质峰响应值最小,而目标对象罗格列酮不受影响。因此,本实验使用外径为10～20 nm 的MWCNTs和PSA混合作为样品净化剂。

表2 不同净化剂使用量的样品回收率Table 2 The recovery rate of different purifying agent dosage

2.4.2 净化剂使用量的确定 净化剂的使用量影响样品回收率和基质消除效果。实验结果(表2)表明,MWCNTs使用量不断增加将导致罗格列酮回收率下降,在MWCNTs使用量一定的条件下,增加PSA使用量对回收率影响较小。综合考虑样品回收率(表2)和基质消除效果(图7),实验5得到样品净化效果最好,净化剂使用量相对较少,回收率较高,故本实验使用MWCNTs 20 mg和PSA 15 mg对1 mL样品提取液进行净化处理。

2.4.3 净化剂作用时间的确定 如图8所示,净化剂与样品提取液作用时间的长短对罗格列酮回收率影响不大,净化效果良好,为提高样品提取效率,本实验选用1 min作为样品净化时间。

2.5 加标回收实验

对3种不同的样品中进行添加回收实验,分析加标样品计算回收率和相对标准偏差(见表3)。方法回收率范围为77.3%～93.2%,相对标准偏差(RSD)范围为1.3%～6.4%,方法具有较高的准确度和精密度。

表3 加标回收实验结果(n=6)Table 3 Results of recovery test(n=6)

图6 不同外径MWCNTs与PSA净化加标苦荞茶样品色谱图Fig.6 The chromatogram of buckwheat tea with standardpretreated by different diameter of MWCNTs and PSA 注:A：外径10～20 nm MWCNTs;B：外径20～40 nm MWCNTs;C：外径40～60 nm MWCNTs。

图7 不同组合净化剂作用的加标苦荞茶样品色谱图Fig.7 The chromatogram of buckwheat teawith standard pretreated by different purifying agent dosage注:A:MWCNTs 15 mg,B:MWCNTs 15 mg和PSA 30 mg,C:MWCNTs 20 mg和PSA 15 mg。

图8 净化时间的确定(n=3)Fig.8 The effect of cleaning time(n=3)

3 结论

降糖类保健食品种类多,成分复杂,样品中基质不仅会污染进样口、色谱柱和检测器,而且会影响检测结果的准确性和精密度。本实验主要针对保健食品样品前处理方法进行改进。样品前处理采用无水甲醇超声提取20 min,使用MWCNTs和PSA对样品提取液进行净化。所建立的罗格列酮HPLC检测方法如下：流动相为乙腈-0.01 mol/L(pH5.5)的乙酸铵溶液,总流速为0.8 mL/min,罗格列酮检测波长为245 nm,方法的线性范围为1.0～50.0 μg/mL,相关系数为0.9997,检出限和定量限分别是0.02 μg/mL和0.06 μg/mL,样品加标平均回收率为77.3%～93.2%,相对标准偏差(RSD)小于10%。实验所使用新型吸附材料MWCNTs具有物理化学性质稳定,吸附能力强和成本低廉等特点,应用于样品前处理过程操作简便,净化过程只需1步,样品前处理40 min内可完成。本方法快速、准确,可满足实际检测的需求,适用于基层大量样品的快速筛查。

[1]程显隆,刘卉,肖新月,等.HPLC-DAD-MS联用法检测中药降糖制剂及胶囊壳中非法添加罗格列酮的研究[J].药物分析杂志,2007,27(9):1325-1328.

[2]吴杨,张圆,闵春艳,等.辅助降血糖类保健食品非法添加化学物质检测方法研究[J].中国执业药师,2014(10):11-14.

[3]余荣斌,徐玲,肖志梅.保健食品中违法添加药物的安全性分析[J].医药导报,2012,31(7):959-961.

[4]刘波,吴婷婷,侯玉兰.解吸附电晕束电离质谱法快速检测功能保健食品中违禁添加的降糖类药物[J].食品安全质量检测学报,2013,4(3):722-729.

[5]王豆,杨欣,程怡凡,等.高效液相色谱法同时鉴定保健胶囊食品中非法添加的9种降糖药成分[J].药物分析杂志,2013,33(8):1377-1381.

[6]吴公平,雷玉萍,李荣玮,等.采用反相高效液相色谱法测定降糖类保健食品非法添加降糖化学药品检验方法的研究[J].中国现代医学杂志,2010,20(9):1380-1382.

[7]刘萌,林苏碧.离子对高效液相色谱法检测中成药及保健食品中添加的化学降糖药[J].药物分析杂志,2010,30(6):1038-1041.

[8]腾军,况磊.高效液相色谱法测定蜂胶中双胍类与噻唑烷二酮类合成降糖药物[J].中国卫生检验杂志,2015,25(10):1522-1524.

[9]余小平,郑明,陈蕾.降糖保健食品和中成药中12种化学药的液相快速筛查[J].中国现代应用药学,2013,30(8):882-886.

[10]吴俊辉,罗辉泰,沈小玲.HPLC-MS/MS检测中药保健品中非法添加成分的研究[J].中药新药与临床药理,2014,25(5):606-610.

[11]朱峰,阮丽萍,马永建,等.超高效液相色谱-串联质谱联用法同时检测降糖类和减肥类保健品中20种非法添加的化学降糖药物[J].色谱,2014,32(1):13-20.

[12]曹梅荣,李强,张冬生,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测降糖类保健食品中的10种非法添加物[J].分析实验室,2015,34(8):896-901.

[13]李岩.茶叶中农药多残留测定时基质效应研究[D].秦皇岛:燕山大学,2013.

[14]超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查茶叶中的204种农药残留[J].色谱,2015,33(6):597-612.

[15]李圣陶,龚吉军,周昱,等.多壁碳纳米管固相萃取技术的应用[J].食品工业科技,2013,34(13):373-377.

[16]Zhao P Y,Wang L,Jiang Y P,et al. Dispersive cleanup of acetonitrile extracts of tea samples by mixed multiwalled carbon nanotubes,primary secondary amine,and graphitized carbon black sorbents[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(16):4026-4033.

[17]冯月超,马立利,贾丽多,等.壁碳纳米管分散固相萃取-液质联测茶叶草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸残留量[J].食品安全质量检测学报,2014,5(4):1147-1154.

[18]Zhao P Y,Wang L,Luo J H,et al. Determination of pesticide residues in complex matrices using multi-walled carbon nanotubes as reversed-dispersive solid-phase extraction sorbent[J]. Journal of Separation Science,2012,35(1):153-158.

[19]Zhao P Y,Fan S F,Yu C S,et al. Multiplug filtration clean-up with multiwalled carbon nanotubes in the analysis of pesticide residues using LC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Separation Science,2013,36(20):3379-3386.

[20]李杨梅,杨敏,谭伟,等.多壁碳纳米管固相萃取-气相色谱法检测蔬菜中毒死蜱、丙溴磷和三唑磷农药残留[J].食品工业科技,2014,35(19):316-325.

[21]彭晓俊,庞晋山,邓爱华,等.改性多壁碳纳米管固相萃取-高效液相色谱法测定农产品中痕量残留的4种有机氯农药[J].色谱,2012,30(9):966-970.

[22]林宏立.单壁碳纳米管在水中农药残留分析前处理中的应用研究[D].福建:福建农林大学,2014.

[23]Zhao P Y,Wang L,Jiang Y P,et al. Dispersive cleanup of acetonitrile extracts of tea samples by mixed multiwalled carbon nanotubes,primary secondary amine,and graphitized carbon black sorbents[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60:4026-4033.

[24]Zhao P Y,Fan S,Yu C S,et al. Multiplug filtration clean-up with multiwalled carbon nanotubes in the analysis of pesticide residues using LC-ESI-MS/MS[J]. Journal of Separation Science,2013,36:3379-3386.

[25]Han Y T,Zou N,Song L,et al. Simultaneous determination of 70 pesticide residues in leek,leaf lettuce and garland chrysanthemum using modified QuEChERS method with multi-walled carbon nanotubes as reversed-dispersive solid-phase extraction materials[J]. Journal of Chromatography B,2015,1005:56-64.

[26]章晴,陈士恒,杨永坛.分散固相萃取-气相色谱法测定茶叶中25 种有机氯与拟除虫菊酯农药残留[J].分析仪器,2013(4):16-22.

[27]赖青海,王琳琳,石垚,等. QuEChERS结合气相色谱-质谱快速测定人参提取物中25种农药残留[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(11):55-60.

[28]曾小星,万益群,谢明勇.气相色谱-电子捕获检测器同时测定茶叶中有机氯及拟除虫菊酯类农药残留[J].分析测试学报,2008,24(6):636-640.

Determination of illegal added rosiglitazone in dietary supplement by multi-walled carbon nanotubes dispersive solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography

HUANG Jia-jia1,JIANG Dong-wen2,YANG Zhao1,LI Yan-jie1,XU Zhen-lin3,*

(1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,China;2.Guangzhou Technical Service Center for Drug Inspection and Review & Licensing,Guangzhou 510410,China;3.College of Food,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

With the aim of developing an optimal sample pretreatment for the determination of illegal added rosiglitazone in dietary supplement,a method was developed using carbon nanotubes dispersive solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography(HPLC). Key parameters that affect impurity removal and recovery of samples were optimized including the sample extraction solvent and extraction time,the type,composition,amount of purifying agent and sample purifying time. The optimal sample pretreatment conditions were achieved as follows:samples were ultrasonically extracted for 20 min using absolute methanol,and. then cleaned up for 1 min with multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs)and N-propyl ethylenediamine(PSA)before analysis. The HPLC method established based on the optimized sample pretreatment conditions exhibited a good linear relationship from 1.0 to 50.0 μg/mL,with the correlation coefficient of 0.9997. The limit of detection and quantification was 0.02 and 0.06 μg/mL,respectively. The mean spike recovery rates for rosiglitazone in dietary supplement were in the range of 77.3%～93.2%,with relative standard deviations(RSD)less than 10%. This method was simple,rapid,low-cost and applicable for the determination of illegal added drug rosiglitazone in dietary supplement.

multi-walled carbon nanotubes;dispersive solid-phase extraction;dietary supplement;rosiglitazone;high performance liquid chromatography

2016-04-06

黄佳佳(1985-)，女，硕士，工程师，研究方向：食品质量与安全，E-mail：ybhuang13@126.com。

*通讯作者:徐振林(1982-)，男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，E-mail：jallent@163.com。

国家自然科学基金项目(31401591)；广东食品药品职业学院院级科研项目(2014YZ004)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)02-0053-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.002