热补针法对寒证类风湿关节炎模型家兔滑膜组织代谢物谱的影响

袁 博 王金海 方晓丽 张星华 田 亮 张婷卓 李兴兰 杜小正 曾华宗

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

热补针法对寒证类风湿关节炎模型家兔滑膜组织代谢物谱的影响

袁 博 王金海1方晓丽 张星华 田 亮 张婷卓 李兴兰 杜小正 曾华宗2

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨比较不同针法对寒证类风湿关节炎(RA)模型家兔滑膜组织代谢物谱的影响及热补针法治疗RA的特异性机制。方法 40只清洁级青紫蓝家兔随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。以卵蛋白诱导联合低温冷冻法建立寒证RA模型。除正常组、模型组外，其余各组分别于足三里穴施以平补平泻、捻转补法、热补针法针刺，1次/d，留针30 min，共7次。治疗结束后分离家兔膝关节滑膜组织，采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q/TOF-MS)检测滑膜组织代谢物，利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)方法对数据进行统计分析。结果 与正常组比较，模型组滑膜组织代谢物变化主要体现于丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂、肌酸、异亮氨酸/亮氨酸、缬氨酸含量降低(P<0.05)；与模型组比较，各针刺组上述代谢物含量增高(P<0.05)，且热补针法组肌酸、异亮氨酸/亮氨酸、缬氨酸含量明显高于平补平泻组和捻转补法组。结论 热补针法通过调节与RA能量代谢相关的氨基酸代谢，在改善RA机体氨基酸的供给及减缓负氮平衡方面有一定的特异性作用。

热补针法；类风湿关节炎；滑膜组织；代谢组学；液相色谱-质谱

类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎为主要病理改变的自身免疫性疾病。针灸疗法对RA具有抗炎镇痛、免疫调节作用〔1〕。“热补针法”是郑魁山教授在传统针刺手法的基础上，把握“烧山火”之精髓，去繁就简而创立的特色手法，是临床治疗RA的结晶。课题组前期的研究表明，热补针法对RA在抗炎镇痛层面具有相对的特异性〔2〕，但前期这些研究尚不能体现针灸多靶点、多层次、多途径以及类似于网络结构的作用特点，缺乏对针刺后机体产生的全部生物信息的综合分析。代谢组学是通过对某一生物、细胞或组织相对分子质量较低(相对分子质量<1 000)的代谢产物进行定性、定量分析检测，从系统生物学角度研究机体发病以及治疗机制的新技术〔3〕。因此，该研究手段的优势与针灸治疗作用特点甚相吻合。本研究以寒证RA模型家兔为载体，采用液质联用技术从系统生物学角度探讨热补针法治疗RA的特异性机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康2～3月龄清洁级青紫蓝家兔40只，雌雄各半，体重(2.5±0.5)kg(购自卫生部兰州生物制品研究所，许可证号：SCXK(甘)2012-0001)。购回后适应性饲养7 d，然后随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。实验过程中对所有动物的处理方法均符合2006年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导意见》的规定。

1.2 主要试剂及仪器 卵蛋白干粉(sigma 公司，批号：A5253-250G)；弗氏完全佐剂(CFA，sigma 公司，批号：F5881)；LC/MS级乙腈(Merck公司)；高效液相色谱检测(HPLC)级甲醇(Merck公司)；甲酸(CNW公司)；针灸针(华成牌，苏州)；LC-Q/TOF-MS仪器分析平台(Agilent)；C18色谱柱(Agilent公司)。

1.3 造模方法 除正常组外，其余各组分别采用卵蛋白诱导联合低温冷冻法建立RA寒证模型〔4〕：实验正式开始前3 d，用电推剃去家兔背部肩胛骨间及双后腿膝关节周围的毛；将4 mg/ml的卵蛋白溶液与等量CFA充分混匀，震荡成乳化剂，以2%碘酒、75%酒精消毒肩背部均匀选定的6个点，用注射器每点皮下注射该乳化剂0.2 ml；14 d后以相同方式、相同剂量重复皮下注射1次；第二次免疫后6 d，消毒家兔后腿双膝关节，向关节内分别注入20 mg/ml卵蛋白生理盐水溶液0.4 ml。在24 h之内膝关节出现红肿触痛，表明模型复制成功。在模型复制成功后第2天，用70%酒精消毒两后腿，上、下、左、右围置冰袋(3份冰+1份结晶氯化钙，粉碎混合，温度降至-20℃～-25℃)冷冻1.5 h，在45℃温水中复温5 min(室温12℃)，共冷冻1次。冷冻后14 d，家兔表现为精神萎靡不振，两后肢匍伏，膝关节肿胀、周径明显大于正常组，局部青紫、皮温不高，表示成功建立寒证RA模型。

1.4 针刺方法 寒证RA模型建立成功后第7天，将家兔用改良后兔台固定，选取“足三里”穴〔5〕。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》〔6〕：操作者左手拇指紧按穴位，右手持针刺入穴内8～12 mm，针刺得气后，左手加重压力，右手拇指向前连续捻按5次；针下沉紧后针尖拉着有感应的部位，连续重插轻提5次；拇指再向前连续捻按5次，反复操作1 min，最后使针下沉紧，留针30 min。平补平泻法、捻转补法操作均参照《刺法灸法学》〔7〕：平补平泻法：针刺得气后，施以前后均匀捻转，不单向捻转，指力均匀，角度180°～360°，频率60～90转/min，反复操作1 min。捻转补法：针刺得气后，在针下得气处小幅度前后捻转针体(角度180°～360°，频率60～90转/min)，拇指向前左转时用力重，指力沉重向下；拇指向后右转还原时用力轻，反复操作1 min。以上各操作每天1次，每次留针30 min，共针刺7 d。

1.5 滑膜样本的采集 针刺治疗结束后，采用空气栓塞法处死各组家兔，分离双侧膝关节滑膜组织，于冻存管内置于-80℃冰箱保存，备测。

1.6 样本处理 ①样本前处理：室温解冻后，吸取100 μl样本于1.5 ml EP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品∶甲醇=1∶4，涡旋30 s，4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取200 μl上清，转入进样小瓶中待检测。②色谱条件：分离色谱柱为C18色谱柱。色谱分离条件：柱温40℃；流速0.35 ml/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见表1。进样量为4 μl，自动进样器温度4℃。③质谱条件：采用正、负离子模式不同条件进行检测，为确保质量的准确性和重复性，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量，正离子模式下产生〔M+H〕+离子556.277 1 D，负离子模式下产生〔M-H〕-离子554.261 5 D。

表1 梯度洗脱程序

1.7 统计学方法 运用Mass Profiler软件对LC/MS数据进行预处理，在Excel2007中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，然后将所有数据归一化到总信号积分。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P13.0软件进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。

2 结 果

2.1 原始色谱图的可视化检查 对所有样本的总离子流色谱图(TIC)进行重叠。初步观察发现仪器的保留时间重现性非常好，仪器稳定，因而提高了仪器分析和数据结果的可靠性。见图1。

图1 所有样本正、负模式下TIC

2.2 PCA 采用PCA观察样本整体分布趋势，各组样本能够较好的分离，各针刺组均向正常组回归，且热补针法组较其他组尤为明显。见图2。

2.3 差异性代谢产物的挖掘及鉴定 见图3，图4，表2，表3。为了更好地获得导致这种差异的代谢物信息，采用OPLS-DA，根据化合物的精确分子量搜索在线数据库(http://metlin.scripps.edu/)，解析化合物的质谱，对化合物进行结构鉴定。选择投影变量重要性(VIP)值(阈值>1)并结合t检验中的P值(阈值<0.05)，筛选出差异物质进行鉴定，并计算差异物质在每两组间变化倍数。具体变化倍数的计算方法：每组样本有8例生物学重复，检测出的每个样本中的每种物质的含量利用峰面积归一化后求得每个物质对应的峰面积值，每组重复中取平均值，进行统计计算，并取以2为底的函数，即为表格中的Fold change值。模型组滑膜组织代谢物变化较正常组主要体现于丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂、肌酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量降低(P<0.05)；各针刺组较模型组上述代谢物增高(P<0.05)，但各针刺组间差异无统计学意义(P>0.05)，而热补针法组肌酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量明显高于平补平泻组和捻转补法组(P<0.05)。

A.正常组；B.热补针法组；C.捻转补法组；D.平补平泻组；E.模型组；下图同图2 各组家兔滑膜组织正、负模式下PCA得分图

图4 各组家兔滑膜组织负模式下OPLS-DA得分图

ViPMasst检验名称FoldchangeViPMasst检验名称Foldchange2.04489.08730.048丙氨酸1.3041)1.513146.14810.014谷氨酰胺3.0993)2.227175.19310.040瓜氨酸23.3591)1.36775.07160.023甘氨酸2.2673)1.522115.13260.008脯氨酸0.7991)1.891147.130760.004谷氨酸5.3053)1.839146.14810.039谷氨酰胺1.0681)1.157379.24190.022鞘氨醇1-磷酸0.9673)1.53075.07160.017甘氨酸2.4091)3.04489.08730.008丙氨酸4.5494)1.711147.130760.044谷氨酸2.8221)1.675175.19310.006瓜氨酸2.2764)1.03989.08730.033丙氨酸2.8492)1.324115.13260.043脯氨酸1.2404)2.042175.19310.045瓜氨酸0.3332)1.345146.14810.009谷氨酰胺0.9474)1.019115.13260.041脯氨酸0.4132)

1)表示正常组与模型组比较，2)表示平补平泻组与模型组比较，3)表示捻转补法组与模型组比较，4)表示热补针法组与模型组比较，5)表示平补平泻组与热补针法组比较，6)表示捻转补法组与热补针法组比较；下表同

表3 负模式下各组潜在生物标志物

-表示下降

3 讨 论

现代医学认为，RA是以关节滑膜炎为主要病理改变的自身免疫系统疾病，虽然其具体发病机制尚未阐明，但随着系统生物学技术的发展，研究发现在RA机体内氨基酸、脂质以及葡萄糖代谢等发生了变化〔8〕。本实验结果发现，RA机体内氨基酸代谢、脂质代谢发生紊乱，与上述研究相符，说明RA的发病机制涉及途径广、层次多等复杂的网络系统。因此，从现代医学角度考虑，其发病机制与针灸的多靶点、多途径、多层次以及类似于网络结构的整体作用特点甚相合拍。

实验研究显示丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺不仅对维持免疫功能起到重要的作用，它们还可作为氧化应激和细胞凋亡的抑制剂〔9〕；甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺三者作为谷胱甘肽(GSH)的重要组成成分，能够保护生物膜免受自由基的损伤；本次实验模型组中上述代谢物含量均降低，可能使RA机体抗氧化能力下降而导致过氧化损伤加重、免疫功能低下、自由基伤害加深。磷脂在磷脂酶的作用下水解为溶血磷脂和自由脂肪酸(FFA)，而溶血磷脂可以加重细胞膜的损伤〔10〕。FFA在酰基辅酶A合成酶(CoAS)作用下与溶血磷脂又合成磷脂〔11〕。因此磷脂代谢异常亦可造成细胞膜受损，本实验模型组中鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂含量均降低，造成细胞膜的损伤。肌酸常作为保护细胞膜的代谢物之一，具有调控细胞凋亡的功能〔12〕，模型组中的肌酸水平明显降低，提示机体内细胞膜的完整性降低、过氧化损伤加重。因此认为，模型组中与细胞膜保护以及免疫功能有关的代谢物含量均降低，导致模型家兔的代谢紊乱，出现细胞膜和自由基的损伤、免疫力下降。针刺治疗后，上述代谢物的含量均升高，提示针刺可减慢细胞膜破坏、过氧化损伤，改善机体的免疫功能。

目前众多研究学者认为炎症反应是RA发病的核心环节，RA滑液中存在着异常的T、B淋巴细胞和显著升高的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素-1、-6、-17以及γ干扰素等促炎细胞因子〔13，14〕，这些因子不仅直接造成RA关节滑膜和组织的破坏，还可通过协同作用使机体出现发热、促神经素释放增多以及补体基因表达上调等反应，从而影响RA机体的能量代谢水平，导致能量代谢不足的表现。体内的异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸作为支链氨基酸，均参与机体蛋白质的合成以及分解过程，具有提供能量底物调节的作用，可维持机体氮的平衡；谷氨酰胺作为机体储藏量最多的必需氨基酸，是各组织供给能量的重要氮源以及能量来源〔15〕。模型组中上述代谢物的含量均降低，提示与能量代谢有关的必需氨基酸代谢发生了紊乱。而在针刺干预后各代谢物含量均升高，尤以热补针法组中各代谢物上升明显，说明热补针法能够调节与RA能量代谢相关的氨基酸代谢，在改善机体氨基酸的供给和减缓负氮平衡方面具有一定的特异性作用。

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〔2016-04-13修回〕

(编辑 袁左鸣)

Metabonomics study on synovial tissues of rheumatoid arthritis cold syndrome rabbit treated with heat-reinforcing needling

YUAN Bo,WANG Jin-Hai,FANG Xiao-Li,etal.

Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Objective To compare the influence of metabolites in synovial tissues of rheumatoid arthritis (RA) cold syndrome rabbits treated with different needling and investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods A total of 40 healthy purple blue rabbits were randomly divided into normal control (NC),model control(MC),reinforcing-reducing needling group (RRN),twirling-reinforcing needling group (TRN) and heat-reinforcing needling group (HRN) (n=8). RA cold syndrome rabbit model was made with ovalbumin and freezing. Except NC and MC,RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli (ST36),TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli (ST36),and HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli (ST36),once a day and retaining 30 min,for 7 times. Fresh synovial tissues of rabbit knee joints were extracted after the intervention,then liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-Q/TOF-MS) technology was used to evaluate metabolic profiles. All the data were analyzed by principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) by using the SIMCA-P(13.0) software for windows. The results were compared. Results The synovial tissues metabolites concerning alanine,citrulline,proline,glutamine,glycine,glutamic acid,sphingolin1-phosphoric acid,lysoph-osphatidylcholine,creatine,isoleucine,leucine,and valine in MC mainly were decreased compared with NC(P<0.05). The above-mentioned metabolites were increased compared with MC and all acupuncture groups (P<0.05),but the metabolites concerning creatine,isoleucine,leucine,valine in HRN were obviously increased than those of RRN and TRN (P<0.05). Conclusions By adjusting the amino acids metabolism which is associated with RA energy metabolism,heat-reinforcing needling has specific effect on RA by improving supply of amino acids and relieving negative nitrogen balance.

Heat-reinforcing needling;Rheumatoid arthritis;Synovial tissue;Metabonomics;Liquid chromatography-mass spectrometry

国家自然科学基金(81260558)；国家中医药管理局甘肃郑氏针法学术流派传承工作室项目(2305135901)；甘肃省自然科学基金(1208RJZA185)；兰州市科技计划项目(2014-1-247)

杜小正(1973-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事传统针刺手法对免疫性疾病的基础和临床研究。

袁 博(1990-)，男，硕士，主要从事传统针刺手法对免疫性疾病的基础和临床研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)04-0800-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.008

1 兰州大学第二医院 2 上海聚类生物科技有限公司