麦胚蛋白对系统性红斑性狼疮的作用机制及其功能分析

黄继红,纪小国,张业奇,赵 祎

(河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001)

麦胚蛋白对系统性红斑性狼疮的作用机制及其功能分析

黄继红,纪小国,张业奇,赵 祎

(河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001)

系统性红斑性狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)因人体免疫系统失调导致人体自身形成抗体来对抗自身的器官或组织,现有治疗手段都有严重的不良反应.根据麦胚的蛋白质全谱,使用GO功能注释和KEGG代谢途径对潜在的麦胚功能蛋白进行分类与分析,重点剖析了麦胚功能蛋白(组蛋白)对系统性红斑狼疮的作用机制,旨在为研究开发植物源免疫活性蛋白提供思路和方法,同时也为医学、生物学、食品工业方面提供宝贵的新资源.

麦胚蛋白;代谢通路分析;系统性红斑性狼疮

系统性红斑性狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种类似风湿性关节炎的发炎性疾病,因人体免疫系统失调导致人体自身形成抗体来对抗自身的器官或组织.皮肤上的病变类似狼颧骨上的红斑,而这个红斑通常就像蝴蝶的形状横过患者的鼻翼两侧[1]，红斑性狼疮会造成关节和肌肉的肿胀，红斑性狼疮病因至今尚未有定论,大量研究显示其发病与遗传、内分泌、感染、免疫异常和一些环境因素有关[2].辅助治疗适用于所有系统性红斑性狼疮患者,包括心理及精神支持、避免日晒或紫外线照射、预防和治疗感染或其他合并症及依据病情选用适当的锻炼方式，药物治疗包括:1) 非甾体类抗炎药(NSAIDS),适用于有低热、关节症状、皮疹、心包炎及胸膜炎的患者,有血液系统病变者慎用;2) 抗疟药氯喹或羟基氯喹,对皮疹、低热、关节炎、轻度胸膜炎和心包炎、轻度贫血和血白细胞计数减少及合并干燥综合征者有效,有眼炎者慎用;3) 糖皮质激素据病情选用不同的剂量和剂型;4) 免疫抑制剂环磷酰胺(CTX)、硫唑嘌呤口服、甲氨蝶呤(MTX)静脉注射或口服、环孢素A(CSA)口服、长春新碱静脉注射等，其他治疗有大剂量免疫球蛋白冲击、血浆置换,适用于重症患者,常规治疗不能控制或不能耐受,或有禁忌症者[3].上述任何一种治疗都有不良反应,如有消化道不适、骨髓抑制、肝脏损害及过敏反应等.激素的不良反应有类库欣征、糖尿病、高血压、抵抗力低下并发的各种感染、应激性溃疡、无菌性骨坏死、骨质疏松及儿童生长发育迟缓或停滞等[4].本课题组前期通过研究麦胚蛋白的全蛋白质组学发现,麦胚蛋白中小分子免疫活性蛋白约90%,具有免疫力调节、抗炎、抗氧化等生理活性[5-6],可作为植物源的免疫调节剂.

麦胚占整个小麦籽粒的3%,我国目前年蕴藏量为420～480万吨,而利用率却不足2%,开发潜力巨大[7].麦胚在我国很早以前就作为药用,如明代医书《免疫类方》记载的补虚、免除疫疠、强气力功效.麦胚作为植物免疫调节剂的研究,对验证和挖掘我国传统药学具有重要意义.

1 材料和方法

1.1 材 料

脱脂麦胚,河南漫天雪食品有限公司;三氟乙酸(TFA),Fluka公司;冰乙醇、生理盐水等常规试剂.

1.2 实验仪器

SHA-CA数显水浴恒温振荡器,常州普天仪器制造有限公司;TDL-5-A离心机,上海安亭科学仪器厂;752N型紫外线可见光光度计,上海精密科学仪器有限公司;雷磁pH计PHS-3E,上海精密科学仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅,河南智诚科技发展有限公司;5810R台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;Neofuge 15R型高速冷冻离心机,上海力申科学仪器有限公司;实验型膜分离设备(双工位平板膜),赛普(无锡)膜科技发展有限公司;LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪,Thermo Finnigan, San Jose, CA;Thermo scientific EASY column(100 μm×2 cm, 5 μm-C18)/Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm, 3 μm-C18),Agilent Technologies, Wilmington, DE.

1.3 试验方法

关于麦胚球蛋白的筛选以及与系统性红斑性狼疮的相关性研究,目前国内外均未检索到相关报道.本文根据麦胚球蛋白的蛋白质全质谱定性与定量分析,通过肽(Peptide)、蛋白质(Protein)、KEGG代谢途径(Metabolic pathway)、GO(Gene ontology)等数据库,以构建麦胚功能蛋白与系统性红斑性狼疮的代谢关系、分析其作用机制.

1.3.1 麦胚球蛋白提取

1) 麦胚用纯净水配制成10%的悬浊液,经自然发酵24 h后,离心取上清液经电泳初步判断分子量范围,为纯化做准备;2) 粗提液(上清液)参照刁大鹏等[8-9]粗提麦胚球蛋白工艺.取500 μL麦胚球蛋白粗提液加1 mL 90%的冰乙醇,-20 ℃沉淀2 h,8 000 r/min离心5 min,弃上清，得到沉淀加入1 mL 17%冰乙醇,-20 ℃沉淀2 h,8 000 r/min离心5 min,弃上清.取二次沉淀,加入1 mL 25%冰乙醇,-20 ℃沉淀2 h,8 000 r/min离心5 min,弃上清,得到的沉淀用适量的0.9%的盐水进行复溶,调配成不同浓度的蛋白质溶液,0.22 μm微膜过滤除菌,4 ℃备用.

1.3.2 基于质谱技术麦胚球蛋白组学分析

质谱流程参照Monaghan[10]和Hentze[11]等的文献,进样方式为纳米喷雾,毛细管温度为200 ℃,检测方式为正离子,多肽和多肽的碎片的质量电荷比,每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS2 scan).

1.3.3 分析软件

质谱测试原始文件(raw file)用Mascot 2.2软件检索Uniprot数据库,功能使用GO注释,代谢途径分析使用KEGG数据库.

2 结果与分析

2.1 麦胚球蛋白蛋白组学分析

麦胚球蛋白经胰蛋白酶水解后的多肽混合物通过LC-MS/MS分析,得到麦胚球蛋白样品酶解液的总离子流色谱图(Basepeak图).图1是将每个时间点质谱图中信号最强肽段的强度连续描绘得到的图谱，横坐标为肽段保留时间,纵坐标为质谱信号强度,数字标记分别为信号峰强度最高肽段的保留时间和质荷比.LC-MS/MS分析,是将酶解后的肽段先经过色谱柱进行分离,洗脱的肽段再进入质谱检测器中进行一级二级质谱分析，该方法适用于复杂样品的分析,可以增加低丰度蛋白质被鉴定出的几率.Basepeak图主要反应样品的色谱分离度、肽段信号强度(可以结合上样体积判断样品酶解情况)、样品蛋白质构成复杂程度等.如果从色谱图上看到在不同时间洗脱的峰较多,而且相对丰度较高,则说明样品肽段种类较多,复杂程度较高,即试验用的麦胚球蛋白样品肽段种类丰富,复杂程度高.通过肽段逆推所得的蛋白质按可信度从低到高依次排列,保守性或同源性较高的蛋白质归为同一蛋白质组,得到584个蛋白质组,包括1 575个蛋白.经与数据库查询比对可知,麦胚球蛋白主要由麦胚球蛋白家族、热休克蛋白(HSPs)、组蛋白、冷调节蛋白、非特异性脂质转移蛋白、α-淀粉酶抑制剂、类燕麦蛋白、麦醇蛋白、木聚糖酶抑制蛋白、晚期胚胎富集蛋白、类甜蛋白、防御素、蛋白酶类及一些未表征蛋白等组成.

图1 麦胚蛋白酶解液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of wheat germ protein hydrolyzate

图2 麦胚蛋白的GO功能注释Fig.2 GO functional annotation of wheat germ protein

2.2 功能GO和代谢途径KEGG分析

2.2.1 功能GO分析

从图2的GO功能注释看出,麦胚蛋白主要参与生命活动中重要的三部分.蛋白质的生物合成过程,即翻译,就是将核酸中由4种核苷酸序列编码的遗传信息,通过遗传密码破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的排列顺序,如:mRNA与遗传密码,tRNA在蛋白质合成过程中起着运输氨基酸的作用，蛋白质必须经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白，麦胚蛋白参与分子功能与细胞形成有关,如催化功能、结构功能、运输功能、贮存功能、运动功能、防御功能、调节功能、信息传递功、遗传调控功能等.麦胚蛋白中各种功能蛋白的比例如图3所示.

图3 麦胚蛋白中各种功能蛋白的比例 Fig.3 The proportion of functional proteins in wheat germ protein

2.2.2 代谢途径KEGG分析

从NCBI等数据库中得到经过GO分析有功能的麦胚蛋白的基因组信息,填入KEGG数据库,并且将同一条通路上有相似功能的蛋白质归为一组,然后打上KO(或K)标签.参与系统性红斑狼疮(SLE)代谢途径的麦胚蛋白质在UniProt数据库登录号为:A0A096UN69 A0A096USW9 W5A444 W5A532 W5EA78 W5F9T2 W5E0R4 W5G400 W5DKT2 W5GES9 W5GJ30 W5GUY7 W5H5H3 W5CBE7 W5EBF3 W5EQ20 W5GDX3 A0A096UJV8 W5EHG8 A0A080YUW8 W5A8H1 W5GER8 W5HYR3 A0A096UKH0 W5GE54 Q43312 A0A0C4BIL8 A0A0C4BKM5 W5BWN6 W5E570 W5BXG6,在KEGG网站主页的检索框输入代谢通路或蛋白,会检索出KEGG中的相关信息,并自动显示此麦胚蛋白参与的反应、相关产物还有参与的通路信息图,麦胚组蛋白家族H2A,H2B,H3,H4等参与的代谢通路如图4所示.从图4的麦胚蛋白参与SLE代谢途径看出：JAK-STAT信号通路一条由细胞因子刺激的信号转导通路,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程，染色质的基本结构是核小体,麦胚中的核小体由组蛋白家族的H2A,H2B,H3,H4构成组蛋白八聚体缠绕于ds-DNA上,通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA中枢神经系统的兴奋性神经)递质,B细胞受体信号通路,解除B细胞免疫耐受,抑制PC12细胞DNA合成从而影响细胞的增殖活性，自身抗体与麦胚中的补体片段(C1q,C4H和C2)相反应,使粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞具有很好的趋化作用,因而在细胞毒反应时能很好地杀死细菌或吞噬炎症组织.

图4 麦胚蛋白参与系统性红斑狼疮(SLE)代谢途径Fig.4 Wheat embryo protein participates in systemic lupus erythematosus (SLE) metabolic pathway

3 结 论

根据麦胚的蛋白质全谱检出结果,通过肽(Peptide)、蛋白质(Protein)、KEGG代谢途径(Metabolic pathway)、GO(Gene ontology)等数据库分析,得到麦胚功能蛋白参与生物过程(合成或代谢),分子功能、细胞功能的分类,与系统性红斑性狼疮的代谢关系,重点剖析了水溶性麦胚功能蛋白对系统性红斑狼疮的作用机制,但是对系统性红斑性狼疮的治疗机理有待进一步系统深入的验证性研究.麦胚蛋白可以作为植物源的免疫调节剂,通过进一步了解植物蛋白种类的多样性和功能的独特性,探知植物蛋白在参与多种生命活动的调控中发挥的重要作用,为研究开发植物源免疫活性蛋白提供思路和方法.同时也为医学、生物学、食品工业方面提供宝贵的新资源,为人类健康及生态保护做出贡献.

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(责任编辑：朱小惠)

Mechanism of wheat germ protein on systemic lupus erythematosus and its functional analysis

HUANG Jihong, JI Xiaoguo, ZHANG Yeqi, ZHAO Yi

(School of Biological Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

Systemic lupus erythematosus (SLE) is caused by the disorder of immune system of human body forming antibodies against human own organs or tissues, and the current treatments have serious adverse reactions. According to the full spectrum of wheat germ protein, the potential functional protein of wheat germ was classified and analyzed by GO function annotation and KEGG metabolic pathway. The mechanism of wheat germ functional protein (histone) on systemic lupus erythematosus was emphatically analyzed. This provides valuable ideas and methods for the research and development of plant-derived immunologically active proteins, and also provides valuable new resources for medicine, biology and food industries.

wheat germ protein; metabolic pathway analysis; systemic lupus erythematosus

2017-01-01

河南省国际科技合作与交流项目(152102410032);郑州市国际科技合作与交流项目(141PGJHZ546);河南工业大学谷物资源转化与利用省级重点实验室开放课题(001254)

黄继红(1965—),女,河南郸城人,教授级高级工程师,博士,研究方向为发酵工程,E-mail:huangjih1216@126.com.

R392.1

A

1674-2214(2017)01-0020-05