精氨酸对Escherichiacoli发酵生产L-色氨酸的影响

杨梦晨,刘镇瑜,陈 宁,徐庆阳

(1.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津 300457;2.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津 300457;3.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457)

精氨酸对Escherichiacoli发酵生产L-色氨酸的影响

杨梦晨,刘镇瑜,陈 宁,徐庆阳

(1.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津 300457;2.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津 300457;3.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457)

色氨酸是人和动物体内必须氨基酸,在食品、饲料及医药工业中具有广泛应用价值.以色氨酸生产菌株EscherichiacoliTRTH为出发菌株,在培养基中添加精氨酸,以降低代谢副产物的积累量,提高L-色氨酸的产量.在30 L发酵罐上考察了精氨酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明:添加0.2 g/L的精氨酸时,菌体生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率分别为41.5 g/L,34.5 g/L和18.0%,较未添加时分别提高了5.46%,5.83%和2.86%,且乙酸积累量较未添加时降低了10.99%.

精氨酸;大肠杆菌;L-色氨酸;乙酸

L-色氨酸属于芳香族氨基酸,其中L-色氨酸可以作为药物提高人的睡眠质量及稳定情绪,也可以作为食品及饲料添加剂[1].目前,获得L-色氨酸的主要方法是直接发酵法[2-3].在L-色氨酸发酵中,改变培养基的组成成分及发酵条件可以提高L-色氨酸的产量[4-5].乙酸是E.coli培养过程中主要的抑制性代谢副产物,且乙酸的积累不仅会抑制菌体生长及目的产物的合成,而且会造成碳源的浪费[3].通过培养工艺的优化或者菌株的基因改造使细菌生长速率与其耗氧速率更加趋于平衡,可以避免培养过程中乙酸的积累.

在培养过程中,乙酸的合成受到培养基成分的影响.在培养基中添加酵母粉、甲硫氨酸、精氨酸及甘氨酸,可以降低乙酸的积累量并提高蛋白的表达水平[6].前期实验证明:L-色氨酸发酵中精氨酸的最佳添加质量浓度为0.2 g/L.因此,在L-色氨酸发酵培养基中添加0.2 g/L精氨酸,考察精氨酸对菌体生物量、L-色氨酸产量、乙酸积累量及葡萄糖消耗速率的影响,以优化L-色氨酸的发酵培养基.

1 实验材料

1.1 菌 种

E.coliTRTH,保藏于天津科技大学工业微生物菌种保藏室.

1.2 主要仪器及设备

5 L和30 L自动控制发酵罐,上海保兴生物设备工程有限公司;752分光光度计,上海分析仪器厂;生物传感分析仪(SBA-40C),山东科学院生物研究所;高效液相色谱仪(Agilent 1200),安捷伦科技(中国)有限公司.

1.3 主要试剂

L-色氨酸、L-精氨酸和盐酸四环素,北京索莱宝科技有限公司;对二甲氨基苯甲醛(分析纯),上海三爱思试剂有限公司;亚硝酸钠(分析纯),天津市北方天医化学试剂厂;乙腈(色谱纯)和甲醇(色谱纯),天津四通化工厂;乙酸(色谱纯),天津化学试剂一厂.

1.4 培养基

1.4.1 活化斜面培养基

酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,盐酸四环素50 mg/L,琼脂粉20 g/L.

1.4.2 保藏斜面培养基

酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,盐酸四环素50 mg/L,琼脂粉20 g/L.

1.4.3 基本培养基

葡萄糖2 g/L,NH4Cl 1 g/L,KH2PO4·3H2O 1.5 g/L,Na2HPO43.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L.

1.4.4 抗性基本培养基

葡萄糖2 g/L,NH4Cl 1 g/L,KH2PO4·3H2O 1.5 g/L,Na2HPO43.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,盐酸四环素50 mg/L.

1.4.5 种子培养基

葡萄糖20 g/L,酵母浸粉7.5 g/L,KH2PO40.75 g/L,KCl 1.9 g/L,(NH4)2SO42 g/L,MgSO4·7H2O 3.15 g/L,FeSO4·7H2O 2.8 mg/L,VB124 mg/L,微量元素混合溶液2 mL,盐酸四环素50 mg/L.

1.4.6 初始发酵培养基

葡萄糖10 g/L,酵母浸粉1 g/L,KH2PO41.5 g/L,KCl 1.9 g/L,(NH4)2SO410 g/L,MgSO4·7H2O 3.15 g/L,FeSO4·7H2O 75.6 mg/L,微量元素混合溶液4 mL,盐酸四环素50 mg/L.

1.5 相关溶液

1.5.1 对二甲氨基苯甲醛比色法测定色氨酸含量的相关溶液

1) 色氨酸储备液(1 g/L):准确称取0.1 g L-色氨酸于100 mL烧杯中,加入适量蒸馏水溶解,然后用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中;2) 对二甲氨基苯甲醛储备液(3 g/L):准确称取1.500 0 g对二甲氨基苯甲醛,溶于500 mL 50%的硫酸溶液中;3) 亚硝酸钠溶液(20 g/L):准确称取0.200 g亚硝酸钠于50 mL烧杯中,加入适量蒸馏水溶解,然后用蒸馏水定容于10 mL容量瓶中.

1.5.2 HPLC直接测定发酵液中L-色氨酸含量的相关溶液

1) L-色氨酸标准储备液:质量浓度为0.02,0.05,0.08,0.1 g/L的L-色氨酸标准储备液;2) 流动相:V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10.

1.5.3 4 mol/L NaOH溶液

称取80 g NaOH溶于少量蒸馏水中,然后定容至500 mL容量瓶中.

1.5.4 4 mol/L HCl溶液

量取分析纯浓盐酸50 mL,溶于150 mL蒸馏水中.

1.5.5 盐酸四环素溶液(10 mg/mL)

准确称取0.5 g盐酸四环素至50 mL烧杯中,并加少量水溶解,然后定容于50 mL容量瓶中.

2 实验方法

2.1 培养方法

2.1.1 斜面活化种子培养

取斜面保藏菌种划线接种于活化斜面,然后将活化斜面放入培养箱中37 ℃培养12 h.

2.1.2 种子培养

以无菌水洗菌,将菌液接入装有3 L种子培养基的5 L发酵罐中,培养温度为36 ℃,利用25%(质量分数)的氨水将pH维持在7.0,通过调节搅拌转速及通气量将溶氧水平维持在20%左右.培养12 h后作为种子液.

2.1.3 发酵培养

在30 L发酵罐中按10%(体积分数)接种量接入种子液;搅拌转速300～800 r/min;初始通气量2 L/min;培养温度为36 ℃;利用25%(质量分数)的氨水将pH控制在7.0;以泡敌消泡;培养过程中,初始葡萄糖质量浓度降至1.0 g/L时,按照一定的脉冲速度将80%(质量分数)葡萄糖溶液流加至培养基中以维持残糖质量浓度1.0 g/L左右.

2.2 分析测定方法

2.2.1 发酵液预处理

取1.0 mL发酵液10 000 r/min离心5 min,取上清液稀释适当倍数,使L-色氨酸质量浓度介于测定方法的线性范围内,然后用0.22 μm微孔滤膜过滤,所得滤液直接进样测定.

2.2.2 对二甲氨基苯甲醛比色法测定发酵液中L-色氨酸含量

在比色管中加入20 μL L-色氨酸溶液或者已处理好的发酵液与1 mL对二甲氨基苯甲醛溶液,混合后在沸水中加热2 min,然后加入1滴亚硝酸钠溶液,再继续加热3 min,随后取出加入5 mL水并用冷水浴冷却,以试剂作空白,在600 nm处测定其吸光值.将发酵液样品的吸光值代入该方法的工作曲线方程,即可得出发酵液中L-色氨酸的含量[7].

2.2.3 高效液相色谱法测定发酵液中L-色氨酸的含量

高效液相色谱分离工作条件[8]:Agilent C18(3.5 μm,150 mm×4.6 mm)分离柱,检测波长278 nm,柱温39 ℃,V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10为流动相,流动相流速为1 mL/min.

2.2.4 发酵液中丙酮酸及乙酸含量的测定

利用BioRrofile 300A Nova(美国Nova Biomedical公司)生化分析仪进行测定[9].

2.2.5 pH测定

采用pH 6.4～8.0的精密pH试纸及发酵罐附带的pH电极进行测定.

2.2.6 溶氧值测定

利用发酵罐的溶氧电极测定发酵过程的溶氧水平.

2.2.7 菌体浓度测定

用蒸馏水将发酵液稀释适当倍数,在600 nm波长下测定OD值,使OD值为0.2～0.9,OD值乘以稀释倍数即为菌体浓度.

2.2.8 菌体干重测定

10 mL发酵液10 000 r/min离心20 min,将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于80 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,然后用分析天平称重,计算菌体干重.

2.2.9 残糖及乳酸浓度测定

采用生物传感分析仪(SBA-40C)测定发酵液中的残糖及乳酸浓度.

3 结果与讨论

在30 L发酵罐中进行L-色氨酸发酵,在发酵培养基中添加0.2 g/L精氨酸为实验组,未添加精氨酸的为对照组,每隔2 h测定发酵液中菌体干重、L-色氨酸产量、乙酸含量和葡萄糖消耗速率.

3.1 精氨酸对菌体生物量的影响

精氨酸对菌体生物量的影响如图1所示.由图1可知:在发酵培养基中添加精氨酸可以提高菌体生物量,试验组和对照组的菌体干重分别为41.5,39.4 g/L,试验组菌体干重较对照组提高了5.33%;在发酵初期,试验组的生物量未高于对照组生物量.原因是精氨酸可降低代谢副产物的积累量,从而降低对菌体生长的毒害作用,有助于生物量的增加.因此,在L-色氨酸发酵中,添加精氨酸可以提高菌体生物量.

图1 精氨酸对菌体生物量的影响Fig.1 The effect of arginine on cell biomass

3.2 精氨酸对L-色氨酸产量的影响

精氨酸对L-色氨酸产量的影响如图2所示.由图2可知:试验组和对照组的最终L-色氨酸质量浓度分别为34.5，32.6 g/L,试验组的L-色氨酸产量较对照组提高了5.83%;在发酵初期,试验组和对照组的色氨酸生成速率基本一致;而在培养中后期,试验组的色氨酸生成速率明显高于对照组.利用E.coli发酵生产L-色氨酸,乙酸积累量的降低可以提高L-色氨酸的产量.添加精氨酸能提高HMP途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力,会增加HMP途径的代谢通量.添加精氨酸使HMP途径代谢流提高,说明碳代谢流由EMP途径向HMP途径发生迁移,有利于L-色氨酸的合成[10].同时,HMP途经代谢流的增加会提高还原力NADPH的供应量,且NADPH的增多对L-色氨酸的生物合成有积极作用[11].因此,在L-色氨酸发酵中,添加精氨酸可以提高L-色氨酸产量.

图2 精氨酸对L-色氨酸质量浓度及其生成速率的影响 Fig.2 The effect of arginine on L-tryptophan concentration and its production rate

3.3 精氨酸对乙酸积累量的影响

图3 精氨酸对乙酸积累量的影响Fig.3 The effect of arginine on acetic acid accumulation

精氨酸对乙酸积累量的影响如图3所示.由图3可知:试验组和对照组的乙酸积累量分别为2.51，2.82 g/L,试验组的乙酸积累量较对照组降低了10.99%.添加精氨酸会显著提高胞内ATP和NADH的水平,胞内高水平的ATP可以为目的产物的合成提供足够的能量物质,从而避免了由于能量不足而需要通过乙酸合成来提供能量.另外,由于钙离子是丙酮酸激酶的强烈抑制剂,会强烈抑制丙酮酸激酶的活力[12].培养基中添加精氨酸会维持Ca2+的浓度,使EMP途径丙酮酸激酶活力降低,减慢EMP途径的酶反应速率,进而降低EMP途径的代谢通量.EMP途径代谢流的减弱,可以缓解EMP途径与TCA循环存在的碳源溢流,使得副产物乙酸积累量降低.由于上述原因,在L-色氨酸发酵中,添加精氨酸可降低乙酸积累量.

3.4 精氨酸对葡萄糖消耗速率的影响

精氨酸对葡萄糖消耗速率的影响如图4所示.由图4可知:在L-色氨酸发酵过程中,培养初期试验组的葡萄糖消耗速率低于对照组,而在培养后期试验组的葡萄糖消耗速率高于对照组.由于EMP途径代谢流的降低会降低葡萄糖的消耗速率,添加0.2 g/L的精氨酸时,发酵前期的葡萄糖消耗速率较低.代谢副产物乙酸积累量的降低及L-色氨酸产量的提高,可提高糖酸转化率.由L-色氨酸的产量及葡萄糖消耗速率计算可得,试验组和对照组的糖酸转化率分别为18%和17.5%,试验组的糖酸转化率较对照组提高了2.86%.

图4 精氨酸对葡萄糖消耗速率的影响Fig.4 The effect of arginine on glucose consumption rate

4 结 论

在色氨酸发酵过程中,培养基中添加精氨酸可降低代谢副产物的积累量,提高目的产物的产量.试验结果表明:L-色氨酸发酵时添加0.2 g/L的精氨酸,生物量、L-色氨酸产量及糖酸转化率分别为41.5 g/L,34.5 g/L和18.0%,较未添加时分别提高5.46%,5.83%和2.86%,且乙酸积累量较未添加时降低10.99%.在发酵过程中添加精氨酸可提高胞内ATP和NADH的水平,胞内高水平的ATP可以为目的产物的合成提供足够的能量物质,从而避免了由于能量不足而需要通过乙酸合成来提供能量;同时添加精氨酸能提高HMP途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力,会增加HMP途径的代谢通量,进而促进L-色氨酸的生成.总之,在色氨酸发酵过程中添加精氨酸对副产物积累量的降低及产物产量的提高具有一定促进作用,但本实验仅针对精氨酸单一因素对L-色氨酸发酵的影响进行探究,其他氨基酸的添加及氨基酸混合添加及其交互作用对发酵的影响有待进一步研究.

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[4] 王东阳,蔡传康,闫汝东,等.正交试验优化L-色氨酸发酵培养基的研究[J].安徽农业科学,2011,39(4):1910-1911.

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(责任编辑：朱小惠)

Effect of arginine on L-tryptophan production byEscherichiacoli

YANG Mengchen, LIU Zhenyu, CHEN Ning, XU Qingyang

(1. National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China; 3. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

L-tryptophan, one of the essential amino acids for human and animals, is widely used in the food, feed stuff and pharmaceutical industries. L-tryptophan producing strainEscherichiacoliTRTH was used as original strain in this article and sodium arginine was added to the medium to decrease the accumulation of by-products and increase the yield of desired product. The effects of sodium arginine on L-tryptophan fermentation were investigated in a 30 L fermentor. The results indicated that when added with 0.2 g/L sodium arginine, the biomass, L-tryptophan production and glucose conversion rate were 41.5 g/L, 34.5 g/L and 18.0%, respectively, increased by 5.46%, 5.83% and 2.86% compared with that without sodium arginine addition, and the accumulation of acetate was decreased by 10.99%.

arginine;Escherichiacoli; L-tryptophan; acetate

2016-05-13

天津市科技支撑计划重点项目(14ZCZDSY00015);天津市科技特派员项目(15JCTPJC57000)

杨梦晨(1991—),男,山东青岛人,硕士研究生,研究方向为代谢控制发酵,E-mail:846756016@qq.com.

TQ92

A

1674-2214(2017)01-0016-04