太平洋杆菌对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制作用

陈小春,严银春,张甲生,朱金鑫,章华伟,王 鸿,2

(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014;2.浙江工业大学 长三角绿色制药协同创新中心,浙江 杭州 310014)

太平洋杆菌对铜绿假单胞菌毒力因子的抑制作用

陈小春1,严银春1,张甲生1,朱金鑫1,章华伟1,王 鸿1,2

(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014;2.浙江工业大学 长三角绿色制药协同创新中心,浙江 杭州 310014)

为了研究太平洋杆菌XC22919(Oceanobacillussp. XC22919)对野生型铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa, PAO1)群体感应(Quorum sensing, QS)系统控制的相关毒素的抑制作用以及抑制效果.以PAO1为检测菌株,在不影响其生长的浓度下,通过吸光度法检测XC22919发酵粗提物对野生型铜绿假单胞菌毒素的抑制率.结果显示:太平洋杆菌XC22919在不影响PAO1生长的浓度下,对其绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶、生物体膜的最高抑制率分别为31%,30%,18%和15%.表明太平洋杆菌XC22919发酵液粗提物可以抑制PAO1相关毒素的分泌,具有很好的筛选群体感应抑制剂的潜力,该结果有助于推动新型抗菌药物的研究.

太平洋杆菌;群体感应抑制剂;铜绿假单胞菌;毒素

随着抗生素的广泛应用甚至滥用,微生物的耐药谱越来越广、耐药强度越来越高、耐药性形成的速度越来越快,细菌对多种抗生素具有耐药性成为了一个不可忽视的健康问题[1],因此迫切需要发现新靶向作用的抗菌药,这些新型抗菌药物针对毒素输送、毒力调控表达和细菌粘附等毒力因子的产生,而不是针对致病微生物生长的基本过程[2].群体感应系统(Quorum sensing,QS)是一种依赖于细菌密度的细胞间信号传导系统,当细菌的密度达到一定阈值的时候,会通过感知自身所产生的自诱导物(Autoinducer,AI)的浓度来调节自身多种生命活动以及种内、种间的群体行为,如生物体膜的形成、生物发光和毒力因子的分泌等[3-4].因为铜绿假单胞菌的致病性是由群体感应系统控制的,所以阻断其群体感应通路可以减弱毒力从而保护机体免受感染[5].这种阻断针对的是特定的信号系统而不是细菌的生长过程,不会产生任何的耐药行为,所以通过抑制群体感应系统治疗细菌感染的方法可以很合理地替代传统的抗生素治疗[6].

海洋多变复杂的环境导致了海洋微生物的多样性[7].目前大多数的处方药都来源于自然资源[8],其中海洋微生物代谢产物由于化学结构的多样性成为开发新型药物的潜在来源.虽然如此,仅有少数海洋来源的天然药物应用于临床治疗,因此该类化合物具有非常大的开发前景[9].科学家通过对海洋生物的研究发现了许多具有QS系统活性的抑制剂,如海洋红藻(Deliseapulchra)分泌产生的卤代呋喃酮与细菌QS信号分子结构类似,可以抑制细菌QS调控的多种功能[10].Sergey Dobretsov等[11]利用紫色杆菌QS报告菌株和大肠杆菌异源表达的Lux群体感应系统菌株,从海洋微生物中筛选得到7种具有抗革兰氏阴性菌AHL群体感应系统的活性物质.本课题组前期以紫色杆菌ATCC12472为报告菌株,采用打孔法对50株分离自东太平洋海山区的细菌进行群体感应抑制活性的筛选,得到了3株细菌群体感应抑制活性较好的菌株,其中活性最好的XC22919菌株被鉴定为太平洋杆菌属细菌.研究XC22919菌株次级代谢产物对铜绿假单胞菌相关毒素的抑制作用,最终从海洋微生物产生的次级代谢产物中寻找潜在的具有群体感应抑制活性的单体化合物.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

活性实验菌株野生型铜绿假单胞菌由浙江省杭州市浙江大学第二附属医院滨江院区微生物科室馈赠,-80 ℃长期保存于本实验室;测试细菌从东太平洋海山区海泥中分离得到,-80 ℃长期保存于本实验.

1.1.2 培养基

1) LB海水琼脂培养基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,琼脂15～20 g/L,海盐33.3 g/L,pH 7.4.

2) LB海水液体培养基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,海盐33.3 g/L,pH 7.4.

3) LB淡水液体培养基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.4.

4) PB培养基:蛋白胨20 g/L,氯化镁1.4 g/L,硫酸钾10 g/L,pH自然.

1.2 方 法

1.2.1 XC22919的发酵培养和粗提物的制备

从LB固体培养基中挑取适量XC22919单菌落,接种到装有100 mL液体培养基的锥形瓶中,30 ℃,180 r/min恒温恒速振荡培养1 d;然后从锥形瓶中吸取5 mL菌液接种到装有400 mL培养基的锥形瓶中,同样条件振荡培养3 d.发酵液8 000 r/min离心10 min,取上清液,用等体积的乙酸乙酯萃取3次.乙酸乙酯相用旋转蒸发仪蒸干得到粗提物,称重,用甲醇溶成50 mg/mL的溶液待用.

1.2.2 XC22919对紫色杆菌CV026紫色素产量抑制和生长抑制实验

将含有外源信号分子的过夜培养的CV026菌液用新鲜LB液体培养基以1∶100比例稀释后,用25 mL的锥形小瓶分装成9组,每组10 mL.其中1个空白组,1个阴性对照组,剩余7组为实验组,每组3个平行样.分别加入前期制备好的XC22919粗提物,使实验组质量浓度为0.05～0.35 mg/mL,阴性对照组加入10 μL甲醇.将其置于30 ℃,150 r/min摇床约18 h,取1 mL菌液,12 000 r/min离心10 min,弃上清,加入1 mL DMSO,漩涡振荡使紫色菌素完全溶解,8 000 r/min离心10 min,吸取上清液检测OD585下的吸光度[12].将过夜培养的CV026菌液稀释100倍,通过测定OD600来检测菌体密度[13].

1.2.3 XC22919对铜绿假单胞菌绿脓菌素产量抑制及生长抑制实验

将过夜培养的铜绿假单胞菌菌液用新鲜PB液体培养基以1∶100比例稀释后,用25 mL的锥形小瓶分装成9组,其中1个空白组,1个阴性对照组,剩余7组为实验组,每组3个平行.分别加入前期制备好的XC22919粗提物,使实验组质量浓度为0.05～0.30 mg/mL,阴性对照组加入10 μL甲醇.将其置于37 ℃,150 r/min摇床约24 h.取6 mL菌液,加入3 mL氯仿进行抽提;抽提后,氯仿层显蓝色,将其转入新的离心管中,并加入1 mL 0.2 mol/L的盐酸混合反应,反应后显粉红色;充分混合后,离心收集上层水相;于OD520测定水相吸光值[14].将过夜培养的铜绿假单胞菌菌液稀释100倍,通过测定OD600来检测菌体密度.

1.2.4 XC22919菌株对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的抑制作用

将过夜培养的铜绿假单胞菌菌液用新鲜PB液体培养基以1∶100比例稀释后,分装成9组,其中1个空白组,1个阴性对照组,剩余7组为实验组,每组3个平行.分别加入前期制备好的XC22919粗提物,使实验组质量浓度为0.05～0.30 mg/mL.将其置于37 ℃,150 r/min摇床约24 h.将菌液于4 ℃,12 000 r/min条件下离心10 min,吸取上清液,并用一次性滤器(0.22 μm)过滤除菌.在1 mL EP管中加入2 mg底物弹性蛋白酶-刚果红(Elastin-Congo Red,ECR)和900 μL反应缓冲液,并加入100 μL细菌上清液,于37 ℃摇床振荡反应4 h.加入100 μL 0.12 mol/L的EDTA终止反应,并将反应物置于冰上5 min,于4 ℃,12 000 r/min条件下离心10 min,去除不可溶的ECR;上清液在OD495处读取吸光度[15].

1.2.5 XC22919菌株对铜绿假单胞菌蛋白水解酶的抑制作用

将过夜培养的铜绿假单胞菌菌液用新鲜PB液体培养基以1∶100比例稀释后,分装成9组,其中1个空白组,1个阴性对照组,剩余7组为实验组,每组3个平行.分别加入前期制备好的XC22919粗提物,使实验组质量浓度为0.05～0.30 mg/mL.将其置于37 ℃恒温摇床中200 r/min培养12 h.将菌液离心除去菌体,上清液用0.22 μm滤膜过滤.取150 μL上清液并加入1 mL 0.3%的偶氮酪蛋白溶液.在37 ℃恒温培养箱中反应15 min,12 000 r/min离心5 min,结束后加入三氯乙酸(10%,0.5 mL)终止反应,离心,取上清液在OD440处读取吸光度[16].

1.2.6 铜绿假单胞菌生物被膜的定量检测

将前期制备好的XC22919粗提物(50 mg/mL)用甲醇分别稀释成2,4,6,8 mg/mL.过夜培养的铜绿假单胞菌用新鲜LB液体培养基按1∶100的比例稀释.稀释后加190 μL至96孔板中并加入不同浓度的稀释好的菌液10 μL.加入10 μL甲醇作阴性对照.培养24 h后除去上层细菌,贴壁细胞用去离子水轻轻漂洗2次.风干后加入200 μL的0.2%结晶紫.染色15 min后再用去离子水轻轻漂洗2次,最后用200 μL 95%乙醇溶解色素.生物体膜含量用OD650处吸光度表示[17].

2 结 果

2.1 XC22919对紫色杆菌CV026紫色菌素产量影响及生长抑制

通过XC22919菌株的粗提物对紫色杆菌CV026紫色素含量和生长抑制实验同步的方法进行有效浓度的摸索.可以从实验结果得到,随着粗提物质量浓度上升,紫色明显变淡甚至消失,可以从表观上判断XC22919菌株粗提物对紫色素具有抑制作用.从图1(a)可以看出:粗提物质量浓度为0～0.15 mg/mL时,紫色杆菌CV026的生长不受到抑制,当粗提物质量浓度达到0.2 mg/mL时,紫色杆菌菌体生长明显受到抑制.通过吸光度检测,从图1(b)可以得出:太平洋杆菌XC22919在不抑制菌体生长的浓度范围内,最大抑制率达到45.23%.因此,XC22919的质量浓度为0～0.15 mg/mL时,对紫色杆菌CV026具有群体感应抑制活性.

(a) XC22919对紫色杆菌CV026紫色菌素的影响

(b) XC22919对紫色杆菌CV026生长的影响

2.2 XC22919对铜绿假单胞菌绿脓菌素产量影响及生长抑制

虽然紫色杆菌和铜绿假单胞菌同属革兰氏阴性菌,都具有LuxI-LuxR群体感应系统,在筛选群体感应抑制剂时,两者的抑制方式可能相同.但是,铜绿假单胞菌至少存在三套群体感应通路,并且不同的毒素由不同的通路控制.因此通过表型明显的紫色杆菌筛选模型筛选出的菌株未必能够抑制铜绿假单胞菌群体感应系统.所以,若后期将进行更加深入的研究,有必要对XC22919粗提物进行铜绿假单胞菌群体感应系统抑制的验证.通过XC22919对铜绿假单胞菌绿脓素含量和菌体生长抑制实验同步进行有效浓度的摸索.从图2(a)可以看出:随着XC22919粗提物质量浓度的上升,绿脓素含量逐渐下降;从图2(b)可以看出:当XC22919粗提物的质量浓度达到0.35 mg/mL时,菌体的生长受到明显抑制.因此,可以得出XC22919对铜绿假单胞菌的有效质量浓度为0.3 mg/mL,最大抑制率为31%.即XC22919粗提物质量浓度为0～0.3 mg/mL时,对野生型铜绿假单胞菌具有群体感应抑制活性,并且具有较好的浓度依赖性.在接下里的所有活性实验中,都会在有效质量浓度(不抑制铜绿假单胞菌生长)范围内进行,否则就不是群体感应抑制.

(a) XC22919对铜绿假单胞菌绿脓菌素的影响

(b) XC22919对铜绿假单胞菌生长的影响

Fig.2 Quorum sensing inhibition inPseudomonasaeruginosaby XC22919

2.3 XC22919菌株对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的抑制作用

弹性蛋白酶是一种可以破坏生物组织和抑制免疫系统的锌金属蛋白酶,是铜绿假单胞菌中的一个重要群体感应表型.从图3可以看出:XC22919粗提物在不抑制铜绿假单胞菌生长的浓度下,对弹性蛋白酶有明显的抑制效果.随着粗提物质量浓度的上升,弹性蛋白酶活性逐渐降低,当质量浓度达到0.3 mg/mL时,最大抑制率为30%.

2.4 XC22919菌株对铜绿假单胞菌蛋白水解酶的抑制作用

同样,蛋白水解酶也是铜绿假单胞菌产生的重要毒素之一,其产生也受铜绿假单胞菌群体感应系统控制.从图3可以看出:XC22919粗提物在不抑制铜绿假单胞菌生长的浓度范围内,对蛋白水解酶活性有抑制效果.当质量浓度达到0.3 mg/mL时,最大抑制率为18%,并且具有较好的浓度依赖性.

2.5 铜绿假单胞菌生物被膜的定量检测

生物体膜是铜绿假单胞菌群体感应的重要表型之一.通过对生物体膜的抑制实验结合生长抑制实验可以判断XC22919提取物是否对铜绿假单胞菌具有群体感应抑制作用.在不抑制铜绿假单胞菌生长的浓度下,通过XC22919对铜绿假单胞菌生物被膜生长的影响,得出XC22919对铜绿假单胞菌生物被膜有明显的抑制效果,最大抑制率为15%,并且具有较好的浓度依赖性.具体结果见图3.

图3 XC22919对铜绿假单胞菌相关毒素抑制结果 Fig.3 Effect of virulence inhibition in Pseudomonas aeruginosa by XC22919

3 结 论

本实验在前期研究的基础上,研究太平洋杆菌XC22919对铜绿假单胞菌相关毒素的抑制作用.铜绿假单胞菌的发病机制是向外界分泌大量的有毒化合物和细胞外降解酶,这些细胞外的致病因素包括弹性蛋白酶、碱性蛋白酶、外毒素A、鼠李糖脂、绿脓菌素、生物体膜等[18].实验数据显示:XC22919对铜绿假单胞菌绿脓素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶、生物体膜的最高抑制率分别为31.4%,30%,18%,15%.XC22919显示了较好的毒素抑制活性,是很有潜力的开发群体感应抑制剂的活性菌株.因此,在后续实验中,我们将会对XC22919进行规模化发酵,将发酵液进行浓缩,然后将化合物进行提取分离纯化,以期得到抑制群体感应的有效化合物,为群体感应抑制剂的进一步研究和开发提供基础.

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(责任编辑：朱小惠)

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The inhibition of virulence factors production inPseudomonasaeruginosabyOceanobacillussp.

CHEN Xiaochun1, YAN Yinchun1, ZHANG Jiasheng1, ZHU Jinxin1, ZHANG Huawei1, WANG Hong1,2

(1. College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2. Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

In order to investigate the virulence factors inhibition ofOceanobacillussp. XC22919 in wild strainPseudomonasaeruginosa(PAO1) which were regulated by quorum sensing system and the inhibitory effect, PAO1 was used to test the virulence factors inhibition activity of crude extract ofOceanmbacillussp. XC22919 without affecting the growth of PAO1. The results showed that the highest inhibition rate of pyocyanin, elastase, azocasein, biofilm formation in PAO1 was 31%, 30%, 18% and 15%, respectively. The result indicated that the crude extract ofOceanobacillussp.XC22919 could inhibit the virulence factors of PAO1 and suggested that XC22919 has good potential in screening quorum sensing inhibitors. The results were helpful for the study of new antibiotics.

Oceanobacillussp.;quorum sensing inhibitor;Pseudomonasaeruginosa;virulence

2017-03-02

国家自然科学基金资助项目(21337005);浙江省自然科学基金资助项目(LY16H300008);浙江省自然科学基金资助项目(LY16H300007)

陈小春(1991—),女,浙江临安人,硕士研究生,研究方向为海洋微生物发酵及其次级代谢产物,E-mail:1325198995@qq.com.通信作者:王鸿教授,E-mail:hongw@zjut.edu.cn.

Q936

A

1674-2214(2017)01-0025-05