Xpert MTB/RIF技术在骨关节结核临床诊断中的应用研究

董伟杰 秦世炳 兰汀隆 范俊 唐恺 李元 严广璇 王桂荣 黄海荣



·论著·

Xpert MTB/RIF技术在骨关节结核临床诊断中的应用研究

董伟杰 秦世炳 兰汀隆 范俊 唐恺 李元 严广璇 王桂荣 黄海荣

目的 评价利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert MTB/RIF，简称“Xpert技术”)快速诊断骨关节结核及其耐药性的临床应用价值。方法 2015年11月至2016年10月连续收集首都医科大学附属北京胸科医院的272例疑似骨关节结核患者的病灶标本，每份标本行涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养、罗氏培养和Xpert技术检测；罗氏培养阳性的结核分枝杆菌行绝对浓度法药物敏感性试验(DST)检测。以临床诊断参考标准(CRS)为金标准，评价涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养、罗氏培养和Xpert技术检测骨关节结核病灶标本中结核分枝杆菌感染的敏感度和特异度。以DST为金标准，评价Xpert技术检测病灶标本中结核分枝杆菌利福平耐药性的敏感度和特异度。结果 以CRS为金标准，涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养、罗氏培养和Xpert技术检测的敏感度分别为23.90%(60/251)、47.81%(120/251)、25.50%(64/251)和78.09%(196/251)；21例非骨关节结核患者标本中4种技术检测结果均为阴性。以DST为金标准，17例对利福平耐药的标本中，Xpert技术检测利福平耐药全部阳性。结论 Xpert技术检测骨关节结核标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度高，并且可同时检测结核分枝杆菌对利福平是否耐药，值得推荐用于临床早期诊断骨关节结核。

结核,骨关节； 核酸扩增技术； 诊断技术和方法； 抗药性； 评价研究

在21世纪，结核病仍然是一个威胁全球公共卫生安全的严重问题，对结核病进行及时准确的早期诊断对控制结核病疫情至关重要。肺外结核是指结核分枝杆菌通过呼吸系统感染而使人患肺结核，由肺部病变通过血液或淋巴系统播散到人体的各个脏器，发生在肺部以外任何解剖部位的结核病。在中国，肺外结核患者约占全部结核病患者的10%～20%，骨关节结核约占肺外结核患者的11.3%～34.5%[1]。骨关节结核病变组织由于处于循环终末端，病灶中结核分枝杆菌数量少，加之脊柱等深部病灶病变组织直接获取困难，传统的培养及涂片法面临阳性率低、时效性差等劣势，直至目前骨关节结核的早期诊断仍然面临挑战。

2010年由美国的Cepheid公司研发的利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert技术”)问世，并在秘鲁、南非、阿塞拜疆及印度的肺结核多中心试验中进行了验证[2]，同年即得到WHO的推荐应用于肺结核的快速诊断[3]。2013年WHO又推荐Xpert技术应用于肺外结核的诊断，但以淋巴结结核、结核性胸膜炎及结核性脑膜炎为主[4]。Xpert技术作为全球第一套全自动一体化半巢式荧光PCR检测系统，以rpoB基因为靶基因，将PCR检测的3个步骤(样品准备、DNA扩增和检测)集成于一体。该技术在专有的反应盒中完成核酸提取、扩增与荧光检测，通过检测rpoB基因是否突变来判断对利福平是否耐药，在100 min内即可报告结核分枝杆菌复合群是否感染和对利福平的耐药情况。

由于骨关节结核发病率低，以脊柱结核危害最大，标本获取的便利性和量均受限，Xpert技术用于骨关节结核临床诊断中的国内国外可借鉴的数据较少。为探讨Xpert技术在骨关节结核早期诊断中的可行性，本研究通过对Xpert技术与罗氏培养及BACTEC MGIT 960检测结果的对比，就Xpert技术的诊断敏感度和特异度进行分析。

对象和方法

一、 研究对象

选取2015年11月至2016年10月期间，首都医科大学附属北京胸科医院骨科收治的疑似骨关节结核患者272例。男137例，女135例；中位年龄为42岁(15～76岁)。根据临床诊断标准分为骨关节结核组251例和非骨关节结核组21例。骨关节结核组诊断脊柱结核者171例，诊断关节结核者80例。所有患者通过手术或穿刺获得至少4 ml的脓液或组织标本，然后进行涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT 960、罗氏培养、药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和Xpert技术检测。

二、 试验方法

1.标本处理：脓液标本依照N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氢氧化钠法进行标本处理[5]。干酪、肉芽及死骨组织在加入适量磷酸盐缓冲液后，应用微型研磨器Fast-prep-24(美国MP Biomeidcals公司)进行匀浆，之后直接接种[6]。

2.涂片抗酸杆菌检查：按照文献[7]中的标准化操作程序执行。

3. BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养：取2 ml标本用于培养，严格按照BACTEC MGIT 960系统操作说明书进行，培养时间设定为42 d。仪器报告阳性后，取培养液进行涂片镜检，若查到抗酸杆菌则为阳性；若未见抗酸杆菌则为阴性。

4.罗氏培养：接种后的改良罗氏培养基置于37 ℃环境下进行分枝杆菌培养，每周检查1次细菌的生长状态，直至有菌落生长为止。以结核分枝杆菌标准株H37Rv作为阳性对照，以空白管作为阴性对照[5]。

5.绝对浓度法药敏试验：按照中国防痨协会基础专业委员会制定的《结核病诊断实验室检验规程》[5]进行。

6. Xpert技术检测：按照Xpert MTB/RIF操作说明书进行。取1 ml标本于有螺旋盖的无菌管中，然后加入2 ml 标本处理液，旋紧管盖，在涡旋振荡器上涡旋振荡10 s，室温静置10 min，在涡旋振荡器上再次涡旋振荡10 s，室温静置5 min，使标本充分液化。吸取2 ml 液化标本至Xpert反应试剂盒，然后将反应试剂盒放置到检测模块，仪器开始进行自动化检测。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。

三、 临床诊断标准

[8]中关于骨关节结核诊断的指导意见，本研究临床诊断为骨关节结核标准为：(1)患者临床症状、体征与影像学(包括X线摄影、CT及MRI检查)发现的局部结核病的脓肿、死骨表现相符；(2)病灶标本的病理学提示为干酪样坏死并为朗罕细胞肉芽肿；(3)病灶标本的微生物学检测证实为结核分枝杆菌感染；(4)规律抗结核药物治疗6个月以上，结核中毒症状及局部症状消失。以上全部符合诊断为骨关节结核。

四、统计学分析

采用Excel 2010软件收集试验数据，应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。以临床诊断标准作为金标准，计算涂片抗酸杆菌检查、BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养、罗氏培养和Xpert技术检测标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度及95%CI。敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%，特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%。

结 果

一、 各种方法检测MTB的比较

细菌学检测结果：272例患者病灶标本中，按照临床诊断标准分为骨关节结核组251例，非骨关节结核组为21例。涂片抗酸染色检查阳性60例(23.90%)，95%CI为18.80%～29.70%；阴性21例(100.00%)，95%CI为83.90%～100.00%。BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养阳性120例(47.81%)，95%CI为41.50%～54.20%；阴性21例(100.00%)，95%CI为83.90%～100.00%。罗氏培养阳性64例(25.50%)，95%CI为20.20%～31.40%；阴性21例(100.00%)，95%CI为83.90%～100.00%。Xpert技术检测阳性为196例(78.09%)，95%CI为72.50%～83.00%，阴性21例(100.00%)，95%CI为83.90%～100.00%(表1)。120例患者的标本进行BACTEC MGIT 960培养阳性者，经菌种鉴定均为MTB感染。

表1 各种检测方法诊断骨关节结核的敏感度和特异度

注 表中括号外数值为“敏感度(%)”或“特异度(%)”；“敏感度”括号内数值分子为真阳性数，分母为真阳性数+假阴性数；“特异度”括号内数值分子为真阴性数，分母为真阴性数+假阳性数

二、 Xpert技术与绝对浓度法药敏试验检测利福平耐药性的比较

罗氏培养阳性的64例患者标本中，9例因标本量未做药敏试验，采用绝对浓度法药敏试验检测结果对利福平耐药者有17例，证实为MDR-TB者有9例。196例Xpert技术检测阳性的患者中，rpoB基因突变的患者有29例。以绝对浓度法药敏试验为金标准，检测结果对利福平耐药的17例患者中，Xpert技术检测均存在rpoB基因突变。

讨 论

一、 Xpert技术快速检测对临床的应用价值

抗酸染色涂片、BACTEC MGIT 960液体培养及罗氏培养等传统技术诊断骨关节结核的敏感度在本研究中不超过50.00%，抗酸染色涂片结果回报时间为1～2 d，BACTEC MGIT 960液体培养技术结果回报时间为2周左右，罗氏培养结果回报时间为3～4周，如果加上药敏试验，回报时间为6～8周[9]，在科学技术不断进步的现代社会，明显不能适应临床需求。传统PCR技术由于假阳性的问题在21世纪初曾被禁用，随着2010年Xpert技术在结核病诊断中的应用，这种半自动的巢式PCR技术解决了标本处理过程中的污染问题，将核酸扩增、提取及荧光检测融为一体，大大地提高了生物安全度，同时按照本研究的结果，在骨关节结核诊断中的敏感度达到惊人的78.09%，将骨关节结核的诊治进程大大提前。

Xpert技术以rpoB基因为靶点，在获取诊断结果同时可以探测到基因是否突变，从而可以证实标本是否对利福平耐药，我国作为全球耐多药结核病高负担国家，骨关节结核耐药情况亦不鲜见[10]。如果不能及时发现耐药，往往导致病灶清除手术失败，出现多次手术的现象，给患者及社会带来巨大经济损失。本研究中，传统罗氏培养在64例阳性患者中，发现了17例利福平耐药者；而Xpert技术在196例患者中发现了29例患者，不仅将耐药治疗的时间大大提前了4～6周，并且发现了传统技术不能鉴别出来的耐药患者，保证了治疗的成功率，节省了大量的治疗经费，带来了良好的社会效益。

二、Xpert技术在国内骨关节结核领域的研究现状

由于骨关节结核所提供的标本为脓液和肉芽组织，与肺结核患者的痰标本在性质方面存在较大差异，因此需针对不同性质标本进行预处理。根据WHO关于不同组织的预处理做出的推荐，使Xpert技术应用在骨关节结核的诊断具有一定的可行性。2013年，WHO推荐Xpert技术用于诊断肺外结核。2014年李力韬等[11]采用Xpert技术对骨关节结核临床标本进行了结核分枝杆菌对利福平的耐药性检测的验证性研究，得出的结论是Xpert技术能够同时对骨关节结核标本行结核分枝杆菌检测与对利福平的耐药性检测，具有很好的临床应用价值，但此研究标本为标本库的冷冻菌株，不能很好地反映在临床中的实际应用价值。2015年Gu 等[12]验证了Xpert技术在骨关节结核的临床应用价值，得出的结果是Xpert技术对骨关节结核诊断的敏感度是82.00%，特异度是100.00%，从一定程度上说明Xpert技术在临床上用于诊断骨关节结核的可行性。2016年唐恺等[13]在膝关节结核诊断中以临床诊断为参考标准，应用Xpert检测技术的敏感度为69.00%，特异度为90.00%。本研究的样本量为272例，以临床诊断标准为金标准，骨关节结核组诊断脊柱结核者171例，诊断关节结核者80例，涵盖了骨关节结核的所有常见发病部位，应用Xpert技术检测的敏感度为78.09%，特异度为100.00%，以更大的样本量再次证实Xpert技术在骨关节诊断中的必要性和可行性。

三、骨关节结核检测的金标准选择及现状

在肺结核对Xpert技术的诊断试验中，多采用结核分枝杆菌培养为金标准[2, 9, 14-15]，这与痰液标本的易获取及含菌量高有很大关系。

骨关节结核属于肺外结核的一种，很多患者从发病到最终确诊往往需要几个月到几年的时间，严重影响了治疗的及时性。随着影像学技术的发展，尤其是MRI技术的推广应用，使得骨关节结核诊断所需时间有所提前。但结核病的细菌学诊断作为最直接可靠的诊断金标准，由于骨关节结核病灶标本不易获得及培养阳性率低的原因，使得细菌学诊断在骨关节结核的诊断中没能很好地发挥作用。骨关节结核因为属于少见疾病，从业人员少，至今尚未制定出合理的、令人信服的诊断标准，在全国范围内如何科学合理地推行临床试验是一个亟待解决的迫切问题。本研究采用的骨关节结核临床诊断标准需要符合以下所有4条：(1)患者临床症状、体征与影像学(包括X线摄影、CT及MRI检查)发现的局部结核病的脓肿、死骨表现相符；(2)病灶标本的病理学提示为干酪样坏死并为朗罕细胞肉芽肿；(3)病灶标本的微生物学检测证实为结核分枝杆菌感染；(4)规律抗结核药物治疗6个月以上，结核中毒症状及局部症状消失。该标准过于严苛，目的是为了尽量减少疑似病例，在一个相对理想的环境下对Xpert技术进行评价，未来有必要采用相对宽松的标准以检验Xpert技术在真实世界中对骨关节结核的诊断效率。

四、骨关节结核标本的获取与Xpert技术的限度

本研究中90%以上的标本为通过手术获取，而手术获取的标本由于患者在术前通常进行了抗结核药物治疗，会影响检测的敏感度；如何在日后通过穿刺技术获得标本，同时减轻病灶负荷是日后发展的方向。

Xpert技术要在骨关节结核快速诊断中发挥作用，也需要与临床穿刺技术相结合，以便在疾病早期获得有意义的病灶组织标本；尤其是在占骨关节结核发病率50%以上的脊柱结核的诊断中，穿刺技术应该得到更多重视。

Xpert技术在骨关节结核应用中受到限制的另外一个因素是标本获取量的问题。在疾病早期穿刺获得的标本中，除非患者病灶内存在较多脓液，否则无法提供同时满足病理、传统培养及Xpert技术检测所需的标本量，即使是在开放手术中所获得的标本，亦同时面临这一问题。因为在中国由于老年人骨关节结核发病呈上升趋势，但老年患者病灶一般相对较局限，以侵蚀椎间盘及相邻终板为主，提供病灶标本的量一般不会超过2 ml。因此，未来如何利用少于2 ml的标本来进行分子生物学检测仍然是一个亟待解决的问题。

五、Xpert技术临床应用的性价比

Xpert技术临床检测的费用是涂片及罗氏培养检测法的2倍，中国是一个发展中国家，如何在推广过程中进一步降低价格也是一个非常迫切需要解决的问题。Meyer-Rath等[16]对南非推行Xpert技术作为常规手段来检测结核病所带来的医疗费用的大幅提升进行了初步测算，认为目前要实现这一筛查目标只适合于中等以上发达国家。由于我国幅员辽阔，各地经济发展不平衡，在一定程度上制约了Xpert技术的推广应用。但对于可疑耐药的患者仍然有必要优先进行Xpert技术的检测，以对治疗方案进行及时调整，希望日后国家的卫生政策能基于此做出相应的调整。

综上所述，Xpert技术作为一种全自动的分子生物学检测技术，大大减少了对标本的人工处理步骤，不仅使生物安全度得到大幅提升，保护了实验室操作人员的健康与安全，而且通过集成一系列模块与荧光探测技术，使得结果获取时间较液体培养及固体培养由以周计算缩短到以小时计算；在临床如果能与穿刺技术结合，将使骨关节结核的实时快速诊断成为现实。

参 考 文 献

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[5] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程. 北京:中国教育文化出版社,2006.

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[11] 李力韬，李洪敏，马远征，等. 应用Xpert MTB/RIF对脊柱结核临床标本行结核分枝杆菌与利福平耐药性检测的验证性研究. 中华骨科杂志,2014,34(2):211-215.

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[15] Gray CM, Katamba A, Narang P, et al. Feasibility and Opera-tional Performance of Tuberculosis Detection by Loop-Mediated Isothermal Amplification Platform in Decentralized Settings: Results from a Multicenter Study. J Clin Microbiol,2016,54(8):1984-1991.

[16] Meyer-Rath G, Schnippel K, Long L, et al. The impact and cost of scaling up GeneXpert MTB/RIF in South Africa. PLoS One,2012,7(5):e36966.

(本文编辑：薛爱华)

Study on GeneXpert MTB/RIF for rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis and detection of rifampin resistance

DONGWei-jie,QINShi-bing,LANTing-long,FANJun,TANGKai,LIYuan,YANGuang-xuan,WANGGui-rong,HUANGHai-rong.

DepartmentofOrthopedics,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity;BeijingBoneandJointTuberculosisDiagnosisandTreatmentCenter,Beijing101149，China

QINShi-bing,Email:qinsb@sina.com

Objective To evaluate the performance of a real-time polymerase-chain reaction (PCR) assay, Xpert MTB/RIF (Xpert), for the rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis (BJTB) and the detection of rifampin (RFP) resistance. Methods The specimens were obtained from 272 patients who were suspected to be BJTB when they visited the Beijing Chest Hospital between November 2015 and October 2016. Smear, BACTEC MGIT 960 culture，Löwenstein-Jensen’s solid culture and Xpert were performed for each specimen, and L-J culture based drug susceptibility testing (DST) was conducted for all the recovered isolates. The sensitivity and specificity of Xpert in detectingMycobacteriumtuberculosiswere assessed in comparison to a composite reference standard (CRS). The sensitivity and specificity of Xpert for detection of RFP resistance was assessed in comparison to the DST results. Results The sensitivities of Smear, BACTEC MGIT 960, culture and Xpert were 23.90% (60/251), 47.81% (120/251), 25.50% (64/251) and 78.09% (196/251) respectively. The results of these 4 techniques were negative in 21 non-tuberculosis patients. Seventeen RFP-resistant isolates were identified by culture based DST. Xpert was 100% concordant with MGIT based DST for the detection of RFP resistance. Conclusion With high sensitivity and specificity, and its ability to detect drug resistance simultaneously in less than 2 h, Xpert is feasible and valuable to be recommended as a quick diagnostic tool for BJTB in clinical practice.

Tuberculosis, osteoarticular; Nucleic acid amplification techniques; Diagnostic techniques and methods; Drug resistance; Evaluation study

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.04.006

北京市科技计划课题(D141107005214002)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院骨科 北京骨关节结核诊疗中心(董伟杰、 秦世炳、兰汀隆、范俊、唐恺、李元、严广璇)，北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室 北京市耐药结核病研究重点实验室(王桂荣、黄海荣)

秦世炳, Email:qinsb@sina.com

2017-02-28)