肉桂酸衍生物抗PRV及其作用机制研究

姚苗苗郭杨丽孙耀贵孙娜乔美娟雷海民王鹏龙李宏全∗

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.北京中医药大学中药学院，北京100029）

肉桂酸衍生物抗PRV及其作用机制研究

姚苗苗1，郭杨丽1，孙耀贵1，孙娜1，乔美娟1，雷海民2，王鹏龙2，李宏全1∗

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.北京中医药大学中药学院，北京100029）

以猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK－15细胞，对27种天然化合物的抗PRV作用进行筛查，并探讨抗PRV活性物质的作用机制。分别将27种天然化合物以不同方式作用于感染细胞，采用细胞病变法（CPE）和噻唑蓝比色法（MTT）测定其细胞毒性及对病毒吸附、复制和直接杀灭的作用。在药物与PRV共同作用于PK－15细胞24、48、72 h后，RT－PCR检测PRV的代表基因IE180、UL30和UL22在胞内的表达量。结果显示，肉桂酸衍生物（cinnamic acid derivative，CAD）具有抗PRV的活性，其EC50为（8.443±0.216）μg/mL，SI为6.6，最高抑制率为76%。3个时间点胞内IE180、UL30和UL22基因的拷贝数显著降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，CAD对PRV有直接灭活作用，其作用机制是阻断PRV在细胞内的生物合成过程，但CAD对PRV的吸附过程没有阻断作用。CAD可作为抗PRV的候选药物。

肉桂酸衍生物；猪伪狂犬病病毒；抗病毒；天然化合物

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病。伪狂犬病病毒属于疱疹病毒家族中的α－疱疹病毒亚科，该病毒引起的仔猪疾病又称为Aujeszky’s病［1］。猪是伪狂犬病病毒的自然宿主。除此之外，PRV还能够感染大多数哺乳动物和一些鸟类动物，高级灵长类包括人在内对该病毒不易感［2］。PRV在世界范围内的大多数国家对猪养殖业造成了严重威胁。伪狂犬病在全世界范围内所造成的经济损失每年高达几十亿美元［3］，仅次于口蹄疫和猪瘟。据报道PRV已在我国20多个省爆发并且造成了巨大的经济损失［4］。目前，接种疫苗作为有效控制PRV病流行的唯一手段存在着诸多缺陷，尤其是病毒变异株的出现。阿昔洛韦（Aciclovir，ACV）于20世纪80年代上市，以其高效低毒被誉为抗疱疹病毒药物发展史上的里程碑［5］。然而ACV耐药株的出现早在20世纪80年代就有报道［6］。并且农业部已将其列入禁用兽药名单。近年来，人们对天然产物的选择性治疗和自然疗法越来越重视，尤其是植物提取物［7］。Gravina等研究槲皮素、桑色素以及反式肉桂酸体外抗马Ⅰ－型疱疹病毒的活性时，发现槲皮素具有直接杀灭病毒、抑制病毒在细胞上吸附和穿入的作用；桑色素在直接杀灭病毒的同时抑制其吸附过程；反式肉桂酸通过抑制病毒在细胞上吸附过程发挥抗病毒作用［8］。从植物提取物中寻找具有抗病毒作用的天然化合物已成为研发抗病毒药物的趋势。

1 材 料

1.1 试剂 DMEM高糖培养基（Sigma产品）、胎牛血清（HyClone产品）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Amresco产品）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma产品）、DNA凝胶回收试剂盒（Omega产品）、小剂量快速质粒DNA提取试剂盒（Omega产品）、DNA Marker（DL1000、2000）、SYBR®Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒（大连TakaRa公司）。T载体（含感受态DH5α细胞）购自北京全式金公司。

1.2 仪器 倒置荧光显微镜（IX81－F72FL/PH；日本OLYMPUS）、CO2培养箱（香港Heal force公司）、凝胶成像系统（江苏捷达）、PCR仪（美国Biorad公司）、琼脂糖水平电泳槽（DYCP－31E型，北京六一仪器厂）、实时荧光定量PCR仪MyiQTM2（美国Bio－rad公司）。

1.3 药物 本试验中所用到的药物是由北京中医药大学雷海民教授提供，所有药物具有明确的化学结构，均采用1%的DMSO进行溶解。母核结构式如图1所示。

1.4 细胞和病毒 PK－15细胞（猪肾上皮细胞），购自中国兽医药品监察所。猪伪狂犬病病毒（PRV）购自中国兽医药品监察所，Bartha株，CVCC：AV249。

2 方 法

2.1 药物细胞毒性测定 将药物溶解后用细胞维持液连续2倍稀释8个梯度，接种到PK－15细胞长至单层的96孔培养板里，同时设有细胞对照组，每个浓度梯度设4个重复，置50 mL/L CO2培养箱37℃培养。每天观察并记录细胞病变情况，72 h后采用MTT法测定各试验组OD值。计算药物毒性导致细胞病变的病变率（Cytopatic ratio，CR），并通过GraphPad PrismTM软件计算出半数安全浓度（50%cytotoxic concentration，CC50）和最大安全浓度（maximum no－cytotoxic concentration，MNTC）。病变率在10%以下对应的药物浓度即为药物的MNTC［9］。

图1 试验所用27种药物的结构式

2.2 病毒毒力的测定 将PK－15细胞接种到96孔细胞培养板，密度为1.5×105个/mL，每孔100μL，待细胞长至单层，将病毒按照10－1～10－9连续10倍倍比稀释，接种细胞，100μL/孔，每个稀释度6个重复，放置37℃、50mL/L CO2培养箱里培养，每日观察细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），72 h后记录每孔细胞病变情况，病毒的毒力采用病毒的半数感染量（Tissue culture infective dose，TCID50）表示，按照Reed－Muench公式计算［10］。

释数对数之间的差＋＞50%病变率的稀释度的倍数

2.3 药物对PRV感染细胞的抑制作用 首先将初浓度为2倍MNTC的药液连续2倍倍比稀释，然后与浓度为200 TCID50病毒液等体积混合（混合后药物最大浓度为MNTC，依次缩小2倍，病毒液的终浓度均为100 TCID50），加到长至单层PK－15细胞的96孔培养板上，药物共设有8个梯度，每个梯度4个重复，同时设有细胞对照组、病毒对照组和阳性药物对照组（ACV），置50 mL/L CO2培养箱37℃培养，每24 h显微镜下观察并记录CPE，待病毒对照组CPE达到80%～90%时，记录各孔病变情况，采用MTT法测定各试验组OD值，计算药物对病毒的抑制率（In⁃hibition ratio，IR）［11］。并通过GraphPad PrismTM软件计算半数有效浓度（50%effective concentration，EC50）。计算选择指数（selection index，SI），SI＝CC50/EC50。筛选出最大抑制率（maximum inhibition ratio，MIR）高于50%且SI＞3的药物做后续抗病毒机制试验研究［12－13］。

为了进一步研究药物抗PRV的作用机制，确定药物在病毒生物合成过程中的作用靶点，通过以下试验初步判断药物抗PRV的机制。

2.4 药物对PRV的直接灭活作用 将药物与病毒液等体积混合（混合后药物终浓度为MNTC，病毒终浓度为100 TCID50），置于37℃，50mL/L CO2培养箱里分别孵育30、60、90、120、150、180、210 min，加到长至单层的PK－15细胞上，每个时间点设4个重复，同时设细胞对照组和病毒对照组，继续培养，待病毒对照组病变达到80%～90%时，观察并记录各孔细胞病变情况，采用MTT法测各试验组OD值，计算药物对病毒的抑制率。

2.5 药物对PRV复制的影响 先将PRV病毒液（浓度为100 TCID50）作用于长至单层的PK－15细胞上，置37℃、50 mL/L CO2培养箱分别吸附1、2、4、6、8、10、12、14 h，弃病毒液，PBS冲洗两遍［14］，加入最大安全浓度的药物，每个时间点设4个重复，同时设细胞对照组和病毒对照组，继续培养，待病毒对照组细胞病变达到80%～90%时，观察并记录各孔细胞病变情况，采用MTT法测定OD值，计算药物对PRV复制作用的抑制率。

2.6 药物对PRV吸附的影响 先将最大安全浓度的药物加到长至单层的PK－15细胞上，置37℃、50mL/L CO2培养箱里分别培养15min、30min、1 h、2 h、4 h、6 h，每个时间点4个重复，再置4℃预冷1 h，弃上清，PBS洗两遍，加入100 TCID50病毒液，4℃继续培养2.5 h，转至37℃、50mL/LCO2培养箱内培养。同时设细胞对照组和病毒对照组。待病毒对照组细胞病变达到80%～90%时，观察并记录各孔细胞病变情况，采用MTT法测定各试验组OD值，计算药物对PRV吸附作用的抑制率。

2.7 RT－PCR检测药物对PRV IE180、UL30、UL22基因拷贝数的影响

2.7.1 重组质粒的制备 长至单层的PK－15细胞接种PRV病毒液，置37℃、50mL/LCO2培养箱内培养60 h，收集细胞样品。提取细胞培养物总RNA。参照反转录试剂盒说明书将其反转录为cDNA，以cDNA为模板PCR扩增PRV IE180、UL30以及UL22基因。采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将目的条带割胶回收，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收PRV IE180、UL30、UL22基因DNA片段。将回收纯化的目的基因与T载体进行连接，转入DH5α感受态细胞中，200μL的转化菌液涂布于不同的LB/Amp/X－Gal/IPTG平板培养基上，置于37℃培养箱培养12～16 h至形成单菌落，挑白色菌落在LB液体培养基继续培养12～16 h，以扩增质粒。按照质粒抽提试剂盒说明书提取重组质粒。重组质粒在上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定，这3个基因的特异性引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7.2 标准曲线的制作 按照参考文献［15］，分别以10倍倍比稀释的重组质粒为定量检测模板，使用相应基因的特异性引物，进行SYBR Green RT－PCR扩增，获取扩增曲线和标准曲线，标准曲线横坐标代表起始拷贝数，纵坐标代表CT值，只需获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

2.7.3 实时荧光定量检测药物对病毒基因拷贝数的影响 PK－15细胞接种到6孔细胞培养板，密度为1.5×105个/mL，长至单层后将培养基弃掉，每孔接种1 mL病毒液和1 mL药液，病毒液终浓度为100 TCID50，药液终浓度为最大安全浓度和二分之一最大安全浓度，同时设有细胞对照组，病毒对照组和ACV对照组，每组3孔重复。培养箱内分别培养24、48、72 h后收集细胞，每孔细胞加入1 mL TRIzol试剂提取总RNA并反转录为cDNA。进行SYBR Green RT－PCR扩增，检测不同时间点药物对PRV IE180、UL30、UL22基因拷贝数的影响。

反应体系：10μL的SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（2×），上下游引物各0.8μL，cDNA模板1.0μL，dH2O补足到20μL。

反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，UL22基因、UL30基因、IE180基因的退火温度分别为59℃、59℃、61℃，进行30 s，共40个循环，95℃10 s，熔解曲线起始温度为65℃，终点温度为95℃，每升高0.5℃持续5 s。

3 结果与分析

3.1 药物对细胞的毒性试验 通过MTT法以及显微镜下所观察记录的细胞病变情况综合测定待测药物对正常细胞的毒性，确定供试药物和ACV的最大安全浓度（MNTC）和50%毒性浓度（CC50）（表2）。

表2 所有药物的细胞毒性试验和抗病毒试验结果

3.2 病毒毒力的测定结果 PRV作用于PK－15细胞，72 h后根据每孔细胞病变情况，最终计算得出PRV在PK－15细胞上的TCID50＝10－5.6，其意义是指将0.1 mL病毒浓度为10－5.6的PRV病毒液接种PK－15细胞上后，最终可使50%细胞感染PRV。

3.3 药物的抗病毒试验结果 通过研究27种供试药物对PRV的抑制作用，表明只有CAD在PK－15细胞上具有有效抗PRV的作用，明显阻断了由PRV导致的细胞病变，选择指数SI为6.6，其抑制率为76%，高于阳性药物ACV的抑制率（68%），最大安全浓度为15.625μg/mL，远远小于ACV（500μg/mL）。显微镜下观察，病毒感染48 h和72 h后，与病毒对照组相比，药物处理组的细胞病变程度都明显减轻，而且随着药物浓度的降低，细胞病变程度逐渐接近于病毒对照组。同时从药物的量效曲线可以看出，药物抗PRV的作用呈现剂量依赖关系，随着药物浓度的降低，抗病毒效果也相应减弱（图2），与眼观结果一致。

图2 CAD 48 h和72 h抗PRV感染PK－15细胞的作用

3.4 药物对PRV直接杀灭作用的结果 将药物与病毒液混合后放置37℃、50 mL/L CO2培养箱分别孵育30、60、90、120、150、180、210 min后作用于PK－15细胞，测定其抗病毒作用。用MTT法确定药物的抑制率，数据由3次独立重复试验所得，表示为mean±SD。药物在所测试的7个不同时间点内抑制率差异不显著，P＞0.05。结果表明，CAD能够直接杀灭PRV，由表3得出各不同孵育时间点之间差异不显著（P＞0.05），说明药物对PRV的直接杀灭作用不呈现时间依赖性。

表3 CAD对PRV直接灭活作用结果

3.5 药物对病毒复制阻断作用的结果 在PRV感染PK－15细胞后不同时间点添加药物，对PRV的增殖均无抑制作用。这一结果表明CAD对PRV整个复制过程没有阻断作用。数据见表4。

3.6 药物对病毒吸附阻断作用的结果 先将药物与细胞在37℃、50 mL/L CO2培养箱共培养不同时间点，再感染PRV，检测CAD能否与细胞表面上的受体互作，从而阻断PRV吸附到PK－15细胞上最终发挥抗PRV作用。结果表明，无论药物与细胞作用多长时间，药物都不能阻断PRV吸附到PK－15细胞上最终引起细胞病变。数据见表5。

图3 CAD分别在不同时间点对PRV的直接灭活作用

表4 CAD对PRV复制阻断作用结果

表5 CAD对PRV吸附阻断作用结果

3.7 荧光定量PCR检测药物对IE180、UL30、UL22基因拷贝数影响结果

3.7.1 药物对PRV IE180基因拷贝数的影响 在24 h和48 h，CAD和ACV均能有效下调IE180基因的表达量，各试验组IE180基因拷贝数与病毒对照组比较差异显著（P＜0.001或P＜0.01），而且CAD对IE180基因的下调作用强于阳性药物，同时CAD对基因表达量的影响呈现剂量依赖性。72 h时，各试验组IE180基因拷贝数与病毒对照比较，CAD在15.625μg/mL时可显著降低IE180基因表达量（P＜0.01），CAD在7.8125μg/mL和ACV处理组对IE180基因的表达量没有显著影响（P＞0.05）。

3.7.2 药物对PRV UL30基因拷贝数的影响 在24 h，48 h和72 h，CAD和ACV均使UL30基因表达量下调，不同处理组UL30基因拷贝数与病毒对照组比较差异显著（P＜0.001）。24 h时，CAD对UL30基因表达量的下调作用比ACV强，随着时间的增加，48 h和72 h时，ACV对UL30基因表达量的抑制作用要强于CAD。

3.7.3 药物对PRV UL22基因拷贝数的影响 在24 h，48 h和72 h，CAD和ACV均使UL22基因拷贝数下调，而且CAD对基因的下调呈现剂量依赖性。在病毒感染的3个时间点，与病毒对照组相比，阳性对照组和CAD（15.625μg/mL）均能极显著降低UL22基因的表达量（P＜0.001）。当CAD的使用浓度在7.8125μg/mL时，能够显著降低UL22基因在24 h（P＜0.05）和48 h（P＜0.001）的表达量。

4 讨论与小结

许多天然化合物之所以被视为抗病毒制剂，是因为它干扰了病毒生物合成的一个或者多个环节，或者将细胞外的病毒粒子直接杀灭，最终，这些化合物将成为临床用药的候选药物［16］。本试验通过药物不同的作用方式，分析药物对病毒复制、吸附以及直接杀灭三方面的影响，初步确定药物抗病毒机制。

进行体外抗病毒药物筛选，药物对病毒抑制率大于50%而且SI大于3时，将其视为有效药物。CAD在PK－15细胞上的最大安全浓度为15.625μg/mL，远远小于阿昔洛韦（500μg/mL），半数毒性浓度（CC50）为55.4μg/mL。通过药物抗病毒试验得到，CAD的半数抑制浓度（EC50）和最大抑制率分别为8.443μg/mL、76%，SI为6.6。该药物抗病毒的作用与药物浓度具有线性关系，即药物需在一定的浓度区间才能发挥药效，过高浓度的药物会对细胞造成损伤，过低浓度的药物将失去抗病毒能力，药物抗病毒作用呈剂量依赖性。

图4 不同时间点CAD对IE180基因拷贝数的影响（∗∗∗表示P＜0.001，∗∗表示P＜0.01）

图5 不同时间点CAD对UL30基因拷贝数的影响（∗∗∗表示P＜0.001）

图6 不同时间点CAD对UL22基因表达水平的影响（∗∗∗表示P＜0.001，∗表示P＜0.05）

Carvalho等研究黄酮类以及酚酸类化合物体外抗犬瘟热病毒（CDV）作用时，通过不同时间点药物添加试验发现，肉桂酸在0 h（肉桂酸与CDV病毒同时作用于细胞）以及2 h（CDV感染细胞2 h后再添加肉桂酸）发挥抗CDV的作用。然而反式肉桂酸在－1 h（肉桂酸与细胞作用1 h后再感染CDV）和0 h（肉桂酸与CDV病毒同时作用于细胞）具有抗CDV的作用［17］。本试验中先将CAD与病毒在37℃分别孵育不同的时间，然后共同作用于PK－15细胞，试验结果表明，CAD在30 min内就可将PRV灭活。

在检测CAD对PRV胞内复制过程的影响时，分别在病毒感染PK－15细胞不同时间段（2～14 h）后，加入CAD，用MTT法检测其对PRV的抑制率。结果发现，无论是在病毒感染后1 h或者14 h后添加药物，均没有抑制PRV在PK－15细胞上的增殖，因此CAD不影响胞内病毒的复制过程。

文献报道，PRV病毒粒子首先由囊膜糖蛋白gC与细胞膜基质层上硫酸乙酰肝素受体互作，然后由囊膜糖蛋白gD特异性的与细胞上受体进一步结合，加强病毒与细胞之间的作用［18］。为了检测CAD能否干扰PK－15细胞上与PRV结合的受体，最终抑制病毒的吸附过程发挥抗病毒作用，先将药物与细胞分别在37℃共孵育不同的时间（15 min～6 h）后，再感染PRV，放置4℃进行吸附。因为4℃条件下，病毒可以完成对宿主细胞的吸附过程，却不能穿入细胞内［19］。结果表明，CAD抗PRV的作用不是通过影响宿主细胞膜特性阻断病毒的吸附来实现的，推测药物没有与细胞表面糖蛋白gC、gD互作来影响病毒的吸附过程。

为了进一步探索药物在胞外直接杀灭PRV病毒粒子后对胞内PRV生物合成的影响，分别在PRV立早期基因（IE）、早期基因（E）和晚期基因（L）中选择一种代表基因，采用荧光定量PCR进行检测。体内研究表明，IE180通过激活以下PRV基因的启动子进而激活基因的表达，比如，US4（gG）、UL12（AN）、UL22（gH）、UL23（thymidine kinase）和UL41［20－22］。UL30为E基因，其编码产物为病毒DNA复制过程中所必需的DNA聚合酶。UL22为L基因，其编码产物为PRV囊膜糖蛋白gH。gH为病毒复制所必需的结构蛋白，对于病毒侵入靶细胞或感染细胞与邻近细胞的融合，以及在小鼠神经系统中的增殖均是必需的。本试验分别在24 h、48 h和72 h检测CAD对IE180、UL30和UL22三个基因拷贝数的影响，结果表明，与病毒对照组相比，CAD（15.625μg/mL）在三个时间点都显著下调了UL30和UL22基因的表达量（P＜0.001），在24 h和48 h显著下调了IE180基因的表达量（P＜0.001）。

综上所述，CAD在最大安全浓度下具有抗PRV的活性，其可能的作用机制是直接灭活细胞外完整的病毒粒子，推测CAD直接灭活病毒的机制与病毒包膜的改变有关，但其与病毒包膜的接触方式以及对包膜形态与功能的影响还有待于进一步的研究证实。

［1］Andrew J.Davison，Richard Eberle，Bernhard Ehlers，et al.The order Herpesvirales［J］.ArchIves of virology，2009，154（1）：171－177.

［2］Klupp B G，Hengartner C J，Mettenleiter T C，et al.Complete，annotated sequenee of the Pseudorabies virus genome［J］.J.Virol，2004，78（1）：424－440.

［3］童光志，陈焕春.伪狂犬病流行现状及我国应采取的防制措施［J］.中国兽医学报，1999，19（1）：l－2.

［4］Zhao X.Diagnosis and therapy onmixed infection of swine fever，pseudorabies，and Eperythrozoon suis［J］.Shanghai J.Animal Husbandry Vet.Med，2009，3：98－99.

［5］陶佩珍.抗疱疹病毒药物研究进展［J］.中国新药杂志，2003，12（4）：253－257.

［6］C SCrumpacker，LESchnipper，S IMarlowe，etal.Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with acyclovir［J］.The New England journal ofmedicine，1982，306（6）：343－346.

［7］SMRates.Plants as source of drugs［J］.Toxicon，2001，39（5）：603－613.

［8］Gravina H D，Tafuri N F，Silva Júnior A，et al.In vitro assess⁃ment of the antiviral potential of trans－cinnamic acid，quercetin and morin against equid herpesvirus 1［J］.Research in veterinary science，2011，91（3）：e158－e162.

［9］Mei－zhen CHEN，Hao－gui XIE，La－wei YANG，et al.In vitro anti－influenza virus activities of sulfated polysaccharide fractions from Gracilaria lemaneiformis［J］.Virologica Sinica，2010，25（5）：341－351.

［10］Reed L J，Muench H.A simplemethod of estimating fifty percent endpoints［J］.Am.J.Epidemiol，1938，27（3）：493－497.

［11］Gescher Kirsten，Kühn Joachim，HafeziWali，et al.Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L.as antiviral principle against herpes simplex virus type－1［J］.Fitoterapia，2011，82（3）：408－413.

［12］Glatthaar－Saalmüller B，Rauchhaus U，Rode S，et al.Antiviral activity in vitro of two preparations of the herbalmedicinal product Sinupret®against viruses causing respiratory infections［J］.Phytomedicine，2011，19（1）：1－7.

［13］Chávez Juliana H，Leal Paulo C，Yunes Rosendo A，et al.Evaluation of antiviral activity of phenolic compounds and derivatives against rabies virus［J］.Veterinary microbiology，2006，116（1）：53－59.

［14］Alvarez AL，Habtemariam S，Juan－Badaturuge M，et al.In vitroanti HSV－1 and HSV－2 activity of Tanacetum vulgare extracts and isolated compounds：An approach to their mechanisms of action［J］.Phytotherapy research：PTR，2011，25（2）：296－301.

［15］田云，任裕其，屈源泉，等.伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立［J］.广东畜牧兽医科技，2009，34（4）：31－33.

［16］Cos Paul，Vlietinck Arnold J，Berghe Dirk Vanden，et al.Antiinfective potential of natural products：how to develop a stronger in vitro＇proof－of－concept＇［J］.Journal of ethnopharmacology，2006，106（3）：290－302.

［17］Carvalho O V，Botelho C V，Ferreira C G，et al.In vitro inhibition of canine distemper virus by flavonoids and phenolic acids：implications of structural differences for antiviral design［J］.Res Vet Sci，2013，95（2）：717－724.

［18］Lisa E Pomeranz，Ashley E Reynolds，Christoph J Hengartner.Molecular biology of pseudorabies virus：impact on neurovirology and veterinary medicine［J］.Microbiology and molecular biology reviews，2005，69（3）：462－500.

［19］Delputte P L，Costers S，Nauwynck H J.Analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment and internalization：distinctive roles for heparan sulphate and sialoadhesin［J］.J.Gen.Virol，2005，86（5）：1441－1445.

［20］Yuan－Yen Chang，Hui－Wen Lin，Min－Liang Wong，et al.Regulation of the vhs Gene Promoter of Pseudorabies Virus by IE180 and EP0，and the Requirementofa Sp1 Site for the Promote r Function［J］.Virus genes，2004，28（3）：247－258.

［21］Ou Chia－Jen，Wong Min－Liang，Chang Tien－Jye.A TEF－1－element is required for activation of the promoter of pseudorabies virus glycoprotein X gene by IE180［J］.Virus genes，2002，25（3）：241－253.

［22］S.Taharaguchi，H.Inoue，E.Ono，et al.Mapping of transcriptional regulatory domainsofpseudorabies virus immediate－early protein［J］.Archives of virology，1994，137（3/4）：289－302.

（编辑：侯向辉）

Cinnam ic Acid Derivative against Pseudorabies Virus and Its Mechanism sin vitro

YAO Miao－miao1，GUO Yang－li1，SUN Yao－gui1，SUN Na1，QIAO Mei－juan1，LEIHai－min2，WANG Peng－long2，LIHong－quan1∗
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi030801，China；2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing100029，China）

27 kinds of natural compoundswere tested for their antiviral activity against pseudorabies virus（PRV）in PRV infected PK－15 cells and determined their antiviralmechanisms.Visualization with the cytopathologic effect（CPE）assay and the 3－（4，5－dimethyithiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide test（MTT）were used to assess the cytotoxic concentrations of compounds and the antiviral effects on viral adsorption，replication and virucidal activity after each compound incubating infected cells in different ways.RT－PCR is adopted to detect the influence of compounds on RPV representative genes（IE180，UL30 and UL22）expression when the compound and PRV simultaneously acted on the cells in 24 h，48 h and 72 h.The results showed that cinnamic acid derivative（CAD）has anti－PRV activity，the EC50valuewas（8.443±0.216）μg/mL，the selectivity indexeswas 6.6 and themaximum inhibition ratiowas76%.The copy numbers of IE180，UL30 and UL22 in cytoplasm are decreased apparently（P＜0.01）in a dose－dependentmanner at three various time－points after CAD and PRV acting simultaneously on the cells.It indicated that CAD could directly inactivate PRV in vitro and themechanism is inhibiting biosynthesis of PRV in cells rather than inhibiting PRV adsorption.CAD could be developed as new anti－PRV drugs for clinical application.

cinnamic acid derivative；PRV；antiviral；natural compounds

2016－10－28

A

1002－1280（2017）04－0006－10

S853.74

农业科技成果转化资金（2014GB2A3000）

姚苗苗，硕士研究生，从事中药调节动物免疫功能及其分子机制研究；郭杨丽，与姚苗苗为共同第一作者。

李宏全。E－mail：livets＠163.com