红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

黄平，蒋锦杏，徐璇，陈丽



红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

黄平，蒋锦杏，徐璇，陈丽

深圳市人民医院，广东深圳 518020

目的 观察红景天苷对胶质瘤U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响，探讨其诱导U87-MG细胞凋亡机制。方法 不同浓度红景天苷和喜树碱加入U87-MG细胞中，作用24 h后，MTT法测定U87-MG细胞增殖，流式细胞术检测U87-MG细胞凋亡率，Transwell法检测U87-MG细胞侵袭能力，间接荧光标记法测定细胞内活性氧（ROS）水平，Western blot检测U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达。结果 与空白对照组比较，各给药组U87-MG细胞生长抑制作用明显，10、50、100 µg/mL红景天苷作用U87-MG细胞后，细胞侵袭能力显著下降，10、50、100 µg/mL红景天苷作用U87-MG细胞48 h后均能诱导U87-MG细胞凋亡；ROS水平与红景天苷浓度呈正相关；10、50、100 µg/mL红景天苷上调Caspase-3、Bax和E-cadherin的表达，下调Bcl-2和N-cadherin和MMP-9的表达。结论 红景天苷可诱导U87-MG细胞凋亡、抑制U87-MG细胞的侵袭能力。

红景天苷；胶质瘤U87-MG细胞；细胞增殖；活性氧；Caspase-3；基质金属蛋白酶-9

脑胶质瘤在临床上多呈恶性，其容易局部扩散，治疗比较困难且易复发，大多数患者预后不良[1]。近年来，随着医学的进步及学科间的不同领域交叉融合，特别是转化医学理念的不断深入，胶质瘤治疗手段取得极大的进步，逐渐形成了一套比较完整的治疗体系[2-3]。临床上普遍采用以手术切除为基础，结合放疗、化疗、免疫、分子靶向等综合治疗策略，这其中包括临床常用的化疗药物替莫唑胺，但其存在一定的毒副作用和耐药性，所以，在低毒性的前提下提高化疗药物的药效显得尤为重要。

红景天苷（salidroside）提取自红景天全草或根茎，是红景天的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性[4-6]。但目前尚未见文献对红景天苷的抗胶质瘤机制进行探讨。因此，本实验以红景天苷为活性物质，通过体外和细胞实验初步观察红景天苷对胶质瘤系U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响，并探讨红景天苷抗血管生成信号通路的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

正常脑细胞和脑胶质瘤细胞系U87-MG，基尔顿生物科技（上海）有限公司，本实验室进行培养。

1.2 药物及制备

红景天苷、喜树碱（20 mg，分析标准品），阿拉丁试剂（上海）有限公司，药物用pH 6.8 PBS配制浓度为1000 µg/mL药液。

1.3 主要试剂与仪器

Caspase-GlooR3试剂盒、非放射性NF-κB EMSA试剂盒，Sigma-aldrich（上海）贸易有限公司；MTT，上海生工生物工程有限公司；小牛血清，杭州四季青生物试剂公司；胰蛋白酶、RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司；FITC/PI双染试剂盒，碧云天生物试剂公司。酸度计（上海雷磁仪器厂），CO2培养箱（美国REVCO公司），流式细胞仪（美国BectonDikinson公司），酶联免疫检测仪（芬兰Labsystems公司），酶联检测仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 U87-MG细胞增殖检测

取200 µL/孔对数生长期U87-MG细胞（1×105/孔）接种于96孔板中，进行培养。培养24 h后，分别加入红景天苷和喜树碱（10、50、100 µg/mL）培养基，设空白对照组，每个药物3个平行孔。分别培养24 h，每孔加5 mg/mL MTT试剂20 µL，继续培养4 h。将培养基吸出，加150 µL DMSO试剂，充分振荡后，充分溶解结晶，于570 nm处测定各孔吸光度（OD），计算细胞活力。细胞活力（%）＝实验组OD值÷空白对照组OD值×100%。

1.5 U87-MG细胞侵袭能力测定

Transwell小室滤膜内表面涂细胞外基质胶，小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的细胞培养基水化。4.0×105/mL重悬浮细胞在Transwell小室下室中加入新鲜10%胎牛血清培养基，上室中加入红景天苷和喜树碱（10、50、100 µg/mL）培养基，设定空白对照组，每个药物设3个平行孔，培养24 h，每孔中加100 µL细胞悬浮液。常规细胞培养24 h。取出小室后，PBS溶液冲洗滤膜，PBS棉棒吸除和擦除上室的细胞，再根据Transwell小室使用说明进行染色观察，计算穿膜细胞数，从而反映各组细胞的侵袭能力。实验重复3次。

1.6 U87-MG细胞凋亡检测

将对数生长期U87-MG细胞以1×105/孔接种于96孔板中，置于恒温恒湿培养箱培养。培养24 h后，分别加入0、10、50、100 μg/mL红景天苷培养基，培养48 h后，收集细胞PBS重新悬浮细胞，先加5 µL FITC-Annexin V避光染色5 min，再加10 µL PI避光染色15 min，室温避光孵育15 min。流式细胞仪检测。

1.7 U87-MG细胞活性氧检测

U87-MG细胞接种后，恒温、恒湿培养24 h后，分别加入红景天苷（10、50、100 µg/mL）的培养基，设3个平行组。加入400 µL DCFH-DA 10 µg/mL，充分混匀后，避光孵育15 min。PBS冲洗去除细胞外荧光剂。PBS重悬细胞10 min后对荧光强度进行检测。

1.8 U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和基质金属蛋白酶-9表达检测

收集对数生长期U87-MG细胞进行相应的空白对照组和红景天苷组处理24 h，进行各组细胞总蛋白的提取，通过Bradford方法调整相同的蛋白浓度后进行电泳，获得根据分子量分离的蛋白条带，按照Western blot显像试剂盒指导说明进行，蛋白NC膜电转，进行蛋白封闭和一抗结合，一抗结合后洗脱，再行二抗孵育标记兔抗大鼠的多克隆抗体。ECL试剂盒显色后，暗室发光拍照，以GAPDH为内参进行分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验结果以±表示，多组间比较采用方差分析和两样本检验。＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷对U87-MG细胞增殖和侵袭能力的影响

与空白对照组比较，各给药组细胞活力和侵袭能力下降（＜0.05，＜0.01），且呈浓度依赖性。结果见表1、图1。

2.2 红景天苷对U87-MG细胞凋亡的影响

随红景天苷组浓度的增加（10、50、100 µg/mL），U87-MG细胞凋亡率不断增加，且呈剂量依赖性，当红景天苷浓度增加到100 µg/mL时，细胞凋亡率为（58.40±2.33）%，诱导U87-MG细胞凋亡的作用增强。结果见图2。

表1 各组U87-MG细胞增殖和侵袭能力比较（±s，%）

注：与空白对照组比较，*＜0.05，**＜0.01

空白对照组红景天苷10 µg/mL组 红景天苷50 µg/mL组红景天苷100 µg/mL组

图1 红景天苷对U87-MG细胞侵袭能力的影响（刚果红染色，×100）

空白对照组红景天苷10 µg/mL组 红景天苷50 µg/mL组红景天苷100 µg/mL组

图2 各组U87-MG细胞凋亡流式细胞图

2.3 红景天苷对U87-MG细胞活性氧水平的影响

与空白对照组比较，细胞内ROS水平随喜树碱浓度的增加变化不明显，而随红景天苷浓度的增加而增加，当红景天苷浓度增加至100 µg/mL时ROS水平最高（＜0.05，＜0.01）。结果见表2。

表2 各组U87-MG细胞ROS水平比较（±s，%）

注：与空白对照组比较，*＜0.05，**＜0.01

2.4 红景天苷对U87-MG细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，随着红景天苷浓度的增加，Caspase-3和Bax的表达呈不断增加的趋势，Bcl-2的表达呈不断减少的趋势，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。结果见表3、图3。

表3 各组U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2和Bax水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，*＜0.05，**＜0.01

A B C D Caspase-317 kD Bcl-228 kD Bax21 kD GAPDH37 kD

注：A. 空白对照组；B.红景天苷10 µg/mL组； C.红景天苷50 µg/mL组；D.红景天苷100 µg/mL组

图3 各组U87-MG细胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达免疫印迹图

2.5 红景天苷对U87-MG细胞侵袭相关蛋白表达的影响

与空白对照组比较，随着红景天苷浓度的增加，E-cadherin表达呈不断增加的趋势，N-cadherin和MMP-9表达呈不断减少的趋势，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。结果见表4、图4。

表4 各组U87-MG细胞E-cadherin、N-cadherin和MMP-9水平比较（±s）

注：与空白对照组比较，*＜0.05，**＜0.01

A B C D E-cadherin135 kD N-cadhein140 kD MMP-9 92 kD GAPDH 37 kD

注：A. 空白对照组；B.红景天苷10 µg/mL组； C.红景天苷50 µg/mL组；D.红景天苷100 µg/mL组

图4 各组U87-MG细胞E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白表达免疫印迹图

3 讨论

信号通路的下放与肿瘤的发生、转移息息相关，众多癌症预后不良反应均与肿瘤喜好通路有关，同时肿瘤组织也会通过内源性因子的调控促进肿瘤细胞的生长。因此，阻截信号通路下放已成为肿瘤靶向治疗的重要手段之一。凋亡是由多种基因严格调控的过程，如Caspase和Bcl-2家族等。Caspase-3是各凋亡通路的靶蛋白[7]，凋亡途径被激活后，引起相应的Caspase蛋白表达的改变，最终将激活Caspase-3诱导细胞凋亡的发生。本实验结果显示，红景天苷能参与并影响Caspase-3级联凋亡途径反应的诱导凋亡通路的表达。线粒体信号途径是线粒体上游信号分子作用于线粒体膜，Bcl-2蛋白活化形成蛋白通道，线粒体PT孔开放，凋亡活性物质释放引起下游Caspase-3蛋白活化并作用于相应底物引起细胞凋亡。Bcl-2是Caspase的上游信号，其中Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白。本实验结果显示，红景天苷参与并下调Bcl-2的表达，增强Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值降低。因此，细胞凋亡可能通过线粒体途径实现的，这与张艳等[8]研究阿魏酸对人胃癌MGC-803细胞增殖的Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达影响趋势一致。

MMP-9作为MMP家族中的一员，能通过降解层黏连蛋白和Ⅳ、Ⅴ型胶原等成分来对肿瘤细胞基底膜成分造成破坏，因此，MMP-9在细胞侵袭中发挥关键作用。N-cadherin通过降低肿瘤细胞间的黏附性，诱导细胞迁移和侵袭率增加，而E-cadherin的下调会影响肿瘤细胞间的连接稳定性，促使肿瘤细胞侵袭的发生[9]。本实验结果发现，红景天苷能诱导E-cadherin表达的增加，N-cadherin和MMP-9表达的降低。因此，红景天苷既可通过抑制MMP-9和N-cadherin的表达，破坏细胞间和基底膜黏附性的能力，又可通过上调E-cadherin的表达，增加肿瘤细胞间的稳定性，进一步抑制U87-MG细胞的迁移和侵袭能力。

本研究考察了不同浓度红景天苷对细胞内ROS的影响，发现红景天苷可以诱导细胞内ROS水平的上升，而ROS是由细胞内氧代谢或外源性氧化剂产生的具有生物活性的氧分子，其在启动和调节细胞凋亡中具有着重要的作用[10-12]。本实验中未发现喜树碱引起细胞内ROS水平的上升，表明红景天苷可促进ROS诱导U87-MG细胞的凋亡。

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Effects of Salidroside on Proliferation and Invasive Ability of Glioma U87-MG Cells

HUANG Ping, JIANG Jin-xing, XU Xuan, CHEN Li

Objective To investigate the effects of salidroside on proliferation and invasive ability of glioma U87-MG cells; To discuss the its mechanism to induce apoptosis of U87-MG cells. Methods U87-MG cells were cultured in vitro for 24 h under different concentrations of salidroside and camptothecin. The proliferation of U87-MG cells was detected by MTT assay. The apoptosis rate of U87-MG cells was detected by flow cytometry. Transwell assay was used to detect the invasive ability of U87-MG cells. ROS was detected by indirect fluorescent labeling. The expressions of Caspase-3, Bcl-2, Bax, E-cadherin, N-cadherin and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in U87-MG cells were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group, U87-MG cells had significant inhibitory effect on the growth of U87-MG cells in each administration group, and the invasive ability of U87-MG cells was significantly reduced after 10, 50, 100 μg/mL salidroside was intervened, and 10, 50, 100 μg/mL salidroside for 48 h for U87-MG cells could induce apoptosis of the cells; the level of ROS was positively correlated with the concentration of salidroside; 10, 50, 100 μg/mL salidroside up-regulated the expressions of Caspase-3, Bax and E-cadherin, and down-regulated the expressions of Bcl-2, N-cadherin and MMP-9. Conclusion Salidroside can induce apoptosis of U87-MG cells and inhibit the invasive ability of U87-MG cells.

salidroside; glioma U87-MG cells; proliferation; ROS; Caspase-3; MMP-9

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.016

R285.5

A

1005-5304(2017)06-0064-04

（2016-08-17）

（修回日期：2016-09-18；编辑：华强）