糖痹康颗粒HPLC指纹图谱研究

王东超，魏颖，高佳琪，孙文，秦灵灵，朱寅荻，徐云玲，石浩霞，刘永巧，屈玲霞，徐暾海，刘铜华



糖痹康颗粒HPLC指纹图谱研究

王东超1，2，3，魏颖1，2，3，高佳琪1，2，3，孙文2，3，秦灵灵2，3，朱寅荻4，徐云玲1，2，3，石浩霞1，2，3，刘永巧1，2，3，屈玲霞1，2，3，徐暾海1，2，3，刘铜华2，3

1.北京中医药大学，北京 100029；2.中医养生学教育部重点实验室，北京 100029； 3.中医养生学北京市重点实验室，北京 100029；4.温州医科大学药学院，浙江温州 325035

目的 建立糖痹康颗粒HPLC指纹图谱，科学评价并有效控制其质量，确保其生产的稳定性。方法 采用德国默克RP-18 endcapped色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈-0.1%甲酸水为流动相梯度洗脱，柱温40 ℃，流速1 mL/min，检测波长240 nm，进样量20 µL。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对10批糖痹康颗粒制剂进行相似度评价，并对处方中的9味药进行相关性分析。结果 以汉黄芩苷为参照峰，初步建立糖痹康颗粒HPLC指纹图谱，10批糖痹康颗粒制剂的HPLC指纹图谱相似度在0.90以上，标示出25个共有色谱峰，其中18个归属到方中各药材。结论 该方法分离效果好、准确、简单，可为糖痹康颗粒质量评价提供参考。

糖痹康颗粒；指纹图谱；相似度

糖尿病的慢性并发症如糖尿病周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变也逐渐成为危害人类健康的杀手[1-2]。糖痹康颗粒由黄芪、桂枝、女贞子、黄芩等中药组成，具有益气养阴、解毒化瘀通络功效，治疗糖尿病周围神经病变疗效显著且安全稳定[3-10]。目前糖痹康颗粒制剂尚无明确的质量控制标准，制备工艺也待考察。为了建立糖痹康颗粒制剂的质量标准，符合现代中药制剂规范要求，保证临床用药安全有效，本研究建立糖痹康颗粒HPLC指纹图谱。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪（型号Alliance e2695，PDA检测器）；Millipore-Q超纯水制备仪，法国密理博公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MS205DU电子天平、ML54电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；移液枪，德国Brand公司。

糖痹康颗粒由本实验室按制剂工艺要求自制；芍药苷（批号B21148，HPLC≥98%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号PM0515SA13，HPLC≥98%）、特女贞苷（批号Z21S3B1，HPLC≥98%）、芍药内酯苷（批号YN1111WA14，HPLC≥91.4%）、千层纸素A（批号Y29D6Y17716，HPLC≥98%）、红景天苷（批号C30S6Q4065，HPLC≥98%）、Oroxyloside（批号Y19D5J1，HPLC≥98%）、白杨素（批号BA0410BA13，HPLC≥98%）、黄芩苷（批号P03M7F10367，HPLC≥98%）、汉黄芩苷（批号ZM0509BA13，HPLC≥98%）、黄芩素（批号C02A6Y1，HPLC≥98%）、汉黄芩素（批号P19O6F4649，HPLC≥98%），上海源叶生物科技有限公司；芒柄花素（批号111703-200603，HPLC≥98%），中国食品药品检定研究院；黄芪（批号1410073，产地甘肃）、女贞子（批号1410025，产地江苏）、桂枝（批号1410028，产地广东）、赤芍（批号1410059，产地吉林）、黄芩（批号1410079，产地北京）、黄连（批号1411030，产地湖北）、水蛭（批号140043，产地安徽）、延胡索（批号1405036，产地浙江）、鸡血藤（批号1408046，产地广西），北京市双桥燕京中药饮片厂，均符合2015年版《中华人民共和国药典》规定；水为Millipore-Q制超纯水；乙腈（色谱纯），Sigma；甲酸（色谱纯），Fisher Scientific；甲醇（分析纯），北京化工厂。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：德国默克RP-18 endcapped色谱柱（5 µm， 250 mm×4.6 mm）；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水，梯度洗脱程序见表1；柱温：40 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：240 nm；进样量：20 µL。

表1 流动相梯度洗脱程序（%）

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 分别精密称取10批糖痹康颗粒，各2.00 g，分别置50 mL量瓶中，加入70%甲醇适量，超声处理（400 W，40 Hz）40 min，定容至刻度，摇匀，过滤，取滤液，作为供试品溶液，进样前用0.45 µm微孔滤膜过滤，供HPLC检测分析。

2.2.2 阳性对照品溶液的制备 分别将黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、水蛭、延胡索、鸡血藤粉碎，过40目筛，各取2.00 g粉末，按“2.2.1”项下方法制备黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、水蛭、延胡索、鸡血藤阳性对照品（单味药）溶液，进样前用0.45 µm微孔滤膜过滤，供HPLC检测分析。

2.2.3 阴性对照品溶液的制备 分别取各味药阴性对照样品（缺少某一味药）2.00 g，按“2.2.1”项下方法，制备成黄芪阴性对照品溶液、女贞子阴性对照品溶液、桂枝阴性对照品溶液、赤芍阴性对照品溶液、黄芩阴性对照品溶液、黄连阴性对照品溶液、水蛭阴性对照品溶液、延胡索阴性对照品溶液、鸡血藤阴性对照品溶液，进样前用0.45 µm微孔滤膜过滤，供HPLC检测分析。

2.2.4 混合对照品溶液的制备 分别取适量对照品黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷、芒柄花素、芍药内酯苷、红景天苷、Oroxyloside，置5 mL容量瓶中，70%甲醇定容，供HPLC检测分析。

2.3 HPLC指纹图谱的建立和相似度分析

分别准确吸取10批糖痹康颗粒样品的供试品溶液和混合对照品溶液，采用“2.1”项下色谱条件，进样测定，记录色谱图。使用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，将10批糖痹康颗粒样品（S1～S10）的图谱数据导入，选取参照谱，时间窗口设为0.5，经多点校正和数据匹配，以中位数法生成对照指纹图谱，进行相似度分析。

10批糖痹康颗粒样品的相似度良好，均大于0.90。根据HPLC图谱中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取25个共有峰为特征指纹峰，选取分离度好、出峰时间适中、峰面积较大且稳定的汉黄芩苷峰作为参照峰。以汉黄芩苷色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积值，共有指纹峰特征参数见图1～图3、表2。10批样品相对保留时间的RSD为0.01%～0.72%，相对峰面积的RSD为0.90%～2.98%，均符合指纹图谱要求。

注：1.红景天苷；2.芍药内酯苷；3.芍药苷；4.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；5.特女贞苷；6.黄芩苷；7.Oroxyloside；8.汉黄芩苷；9.黄芩素；10.芒柄花素；11.汉黄芩素；12.白杨素；13.千层纸素A

表2 10批糖痹康颗粒相似度

2.4 各特征峰归属考察

阳性对照品和阴性对照品色谱图对比见图4。通过保留时间与光谱信息对比，对指纹图谱中的部分共有峰进行了归属。其中峰1、峰6、峰7、峰8均来自赤芍，峰2可能来自桂枝、黄连、女贞子，峰3可能来自赤芍、黄连、女贞子，峰4来自鸡血藤，峰5、峰12来自女贞子，峰9来自黄芪，峰10、峰14、峰15、峰16、峰18、峰20、峰22、峰23、峰24、峰25均来自黄芩，峰11来自延胡索或者黄芩，峰13来自赤芍或延胡索，峰17来自黄芩或桂枝，峰19来自桂枝或赤芍，峰21来自鸡血藤或黄芪。共指认10个色谱峰：峰4（红景天苷）、峰7（芍药内酯苷）、峰8（芍药苷）、峰9（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、峰12（特女贞苷）、峰14（黄芩苷）、峰16（Oroxyloside）、峰18（汉黄芩苷）、峰20（黄芩素）、峰21（芒柄花素）、峰22（汉黄芩素）、峰23（白杨素）、峰25（千层纸素A）。

注：S1.样品；S2.黄芪（-）；S3.黄芪（+）；S4.女贞子（-）；S5.女贞子（+）；S6.桂枝（-）；S7.桂枝（+）；S8.赤芍（-）；S9.赤芍（+）；S10.黄芩（-）；S11.黄芩（+）；S12.黄连（-）；S13.黄连（+）；S14.水蛭（-）；S15.水蛭（+）；S16.延胡索（-）；S17.延胡索（+）；S18.鸡血藤（-）；S19.鸡血藤（+）；S20.混合对照品

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 精密吸取70%甲醇溶液20 µL作为空白溶液，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果表明，空白溶液对测定结果无干扰。

2.5.2 精密度考察 取同一糖痹康颗粒供试品溶液，按“2.1”项色谱条件重复进样6次，共有峰相对保留时间RSD值为0.01%～0.98%，共有峰相对峰面积RSD值为0.48%～2.73%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.5.3 重复性考察 取同一批糖痹康颗粒样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，结果共有峰相对保留时间RSD值为0.01%～0.36%，共有峰相对峰面积RSD值为0.29%～3.05%，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.5.4 稳定性考察 取同一糖痹康颗粒供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定指纹图谱。结果共有峰相对保留时间RSD值为0.02%～1.05%，共有峰相对峰面积RSD值为0.94%～3.02%，表明供试品溶液在24 h内成分稳定，符合指纹图谱的技术要求。

3 讨论

本试验分析了100%甲醇、70%甲醇、30%甲醇对糖痹康颗粒提取的影响。结果显示，70%甲醇效果较好。同时，试验考察了不同超声时间（20、30、40、50、60 min）对糖痹康颗粒提取的影响，结果显示，超声40 min优于20、30 min，与50、60 min无差异。所以，选择70%甲醇超声40 min。

本试验考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈- 0.1%甲酸水等多种流动相系统，结果显示，选用乙腈- 0.1%甲酸水系统略优于其他溶剂系统。故选用乙腈-0.1%甲酸水系统作为流动相。

取混合对照品溶液，在190～400 nm波长范围内扫描，结果显示，不同对照品在不同波长处都有最大吸收，黄酮类成分在250～280 nm均有较强吸收，而苷类成分在200～230 nm有较强吸收，为了整体有较好的吸收，选择240 nm。

本试验通过对精密度、稳定性、重复性方法学考察，可知糖痹康颗粒中25个共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积的RSD＜3%，表明所建立的指纹图谱测定方法符合中药色谱指纹图谱建立的技术要求，可用于糖痹康颗粒的测定。通过对10批糖痹康颗粒进行HPLC指纹图谱构建，标定了25个共有峰，对其中13个共有峰进行确认，分析了糖痹康颗粒的HPLC指纹图谱与各药饮片HPLC图谱的相关性，对25个峰进行可能归属，明确18个峰。其中黄芪、女贞子、桂枝、赤芍、黄芩、黄连、延胡索、鸡血藤均有体现，而水蛭未能得到体现，可能在204 nm处吸收波长较弱或提取方法不适合。糖痹康颗粒HPLC指纹图谱未体现共有峰表达的药材，尚有待进一步研究。10批糖痹康颗粒相似度均在0.90以上，表明糖痹康颗粒的制备工艺稳定可行，也表明所建立的指纹图谱的色谱条件具有较好的适用性，为糖痹康颗粒的有效成分研究及其质量评价提供了依据。

[1] DESHPANDE A D, HARRIS-HAYES M, SCHOOTMAN M. Epidemiology of diabetes and diabetes-related complications[J]. Phys Ther,2008, 88(11)：1254-1264.

[2] REUTENS A T, ATKINS R C. Epidemiology of diabetic nephropathy[J]. Contrib Nephrol,2011,170：1-7.

[3] 吕翠岩,张胜容,赵文景,等.糖痹康治疗糖尿病周围神经病变的临床研究[J].天津中医药,2016,33(1)：5-8.

[4] 吕翠岩.糖痹康干预糖尿病周围神经病变临床及作用机制研究[D].北京：北京中医药大学,2014.

[5] 张宏.糖尿病周围神经病变证候规律研究及糖痹康干预高糖环境内皮细胞的机制研究[D].北京：北京中医药大学,2012.

[6] 谢勤.糖痹颗粒对DM大鼠周围神经病变防治作用的机制研究[D].合肥：安徽中医药大学,2014.

[7] 易文明.糖痹康治疗糖尿病周围神经病变的疗效观察及机制研究[D].北京：北京中医药大学,2015.

[8] 张雅娴.糖痹康方治疗糖尿病周围神经病变的随机对照研究[D].兰州：甘肃中医学院,2014.

[9] 吕翠岩,张胜容,徐暾海,等.糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经p38丝裂素活化蛋白激酶及血浆肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].中国中医药信息杂志,2016,23(3)：67-69.

[10] 吕翠岩,李秋明,毛颖秋,等.糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠血浆β-内啡肽的影响[J].中国中医药信息杂志,2014,21(4)：49-52.

Study on HPLC Fingerprints ofGranules

WANG Dong-chao1,2,3, WEI Ying1,2,3, GAO Jia-qi1,2,3, SUN Wen2,3, QIN Ling-ling2,3, ZHU Yin-di4, XU Yun-ling1,2,3, SHI Hao-xia1,2,3, LIU Yong-qiao1,2,3, QU Ling-xia1,2,3, XU Tun-hai1,2,3, LIU Tong-hua2,3

Objective To establish the HPLC fingerprints ofGranules; To scientifically evaluate and effectively control the quality ofGranules; To ensure its production stability. Methods HPLC was performed on the column of Germany Merck RP-18 endcapped (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) with mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid water; column temperature was 40 ℃; flow rate was 1.0 mL/min; detection wavelength was 240 nm; volume injection was 20 µL. Fingerprint Similarity Evaluation Software (edition 2004A) of Chinese Pharmacopoeia Commission was used to evaluate the similarity of the 10 batches ofGranules, and to analyze the correlations of 9 ingredients inGranules. Results Wogonoside was used as the reference peak, and the common mode for the HPLC fingerprints was set up. The similarities of the 10 batches ofGranules were above 0.930, and altogether 25 common peaks in the chromatograms were found, of which 18 peaks were assigned to Chinese materia medica inGranules. Conclusion The method has good separability and is accurate and simple, which can provide references for the quality control ofGranules.

Granules; fingerprints; similarity

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.019

R284.1

A

1005-5304(2017)06-0075-04

国家科技重大专项-重大新药创制（2012ZX09102201-001）

徐暾海，E-mail：thxu@yahoo.com

（2016-10-25）

（修回日期：2016-11-22；编辑：陈静）