肉豆蔻总木脂素纯化工艺及其抗炎活性研究

张慧，王静，袁子民，胡娜



肉豆蔻总木脂素纯化工艺及其抗炎活性研究

张慧1，王静2，袁子民2，胡娜2

1.沈阳市第二中医医院，辽宁沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁大连 116600

目的 优化肉豆蔻总木脂素的纯化工艺并对其抗炎活性进行研究。方法 采用大孔吸附树脂法富集纯化肉豆蔻总木脂素，以吸附率、解吸率及总木脂素含量为指标，考察树脂型号、洗脱剂浓度、上样量及洗脱剂用量等相关参数；采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型，通过测定肿胀度、抑制率考察其抗炎活性。结果 总木脂素的纯化采用AB-8型树脂，取粗提物干膏1 g溶解后作为上样液，加入40 mL（含树脂16 g）预处理的树脂，静态吸附12 h，上柱，以2 BV/h流速，先用30%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇300 mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，纯度可达45.8%。肉豆蔻总木脂素高、中、低剂量组的肿胀度与模型组比较，差异均有统计学意义（＜0.05）。结论 总木脂素纯化工艺稳定、重复性好，肉豆蔻总木脂素具有明显的抗炎活性。

肉豆蔻；总木脂素；抗炎

肉豆蔻始载于《本草拾遗》，目前收载于2015年版《中华人民共和国药典》（一部）[1]，作为“药食同源”中药，主要用于临床及调味品香料。现代研究表明，肉豆蔻中主要含有苯丙素、脂肪油、挥发油及木脂素等化学成分，其中总木脂素含量为0.9%～2.2%。木脂素类成分具有抗炎、抗氧化、保肝等药理作用[2-3]。目前，分离得到的木脂素类成分主要有利卡啉-B、肉豆蔻木脂素及去氢二异丁香酚等[4]。由于总木脂素类成分含量较低，本研究采用大孔吸附树脂富集纯化肉豆蔻总木脂素，并对其抗炎活性进行研究，为肉豆蔻总木脂素的深入研究及开发利用奠定基础。

1 仪器、试药与动物

U-3010紫外可见分光光度计，日本日立公司；JY92-2D超声波细胞破碎机，宁波新芝生物科技有限公司；AR2140型万分之一电子分析天平，上海奥豪斯公司；KQ3200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

肉豆蔻（批号140915），购于大连权健中药饮片有限公司，经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为肉豆蔻科植物肉豆蔻Houtt.的干燥成熟种仁；去氢二异丁香酚对照品（批号11838-201102，供含量测定用），中国食品药品检定研究院；阿司匹林（批号20130618），沈阳延风制药有限公司；二甲苯（批号20110423），辽宁新兴试剂有限公司；乙醇等试剂均为分析纯，水为蒸馏水；D-101（非极性）、AB-8（弱极性）、DM-301（中极性）大孔吸附树脂，安徽三星科技有限公司。

SPF级KM小鼠50只，体质量18～22 g，4～6周龄，雌雄各半，辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（辽）2010-0001。

2 方法与结果

2.1 总木脂素含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取去氢二异丁香酚对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.15 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的制备 分别精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇为空白，于275 nm波长处测定吸光度（A）。以A为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得方程＝0.091 2＋0.004 5（＝0.999 7）。结果表明，去氢二异丁香酚浓度在1.5～9.0 μg/mL范围内线性关系良好[5]。

2.1.3 测定法 取粗提物或纯化后的干膏0.02 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀后过滤，精密量取续滤液0.5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按“2.1.2”项下方法测定，计算总木脂素含量[5]。

2.2 总木脂素纯化工艺研究

2.2.1 总木脂素粗提物的制备 取肉豆蔻粗粉200.0 g，加入90%乙醇提取2次，每次1.5 h，加醇量分别为10倍量（第1次）及8倍量（第2次），合并提取液，于-20 ℃冰箱中静置24 h后取出，趁冷过滤，滤液回收乙醇后，减压浓缩至约200 mL，再加水稀释至400 mL，搅匀，4000 r/min离心30 min，弃去上清液，取沉淀物，加水200 mL，超声分散，得混悬液，加入等体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯，50 ℃真空干燥至恒重，得粗提物[6]。

2.2.2 大孔吸附树脂的预处理 分别取D-101、AB-8、DM-301型大孔吸附树脂，加乙醇浸泡24 h，再用乙醇洗至洗脱液加适量蒸馏水混合时无白色浑浊现象，最后用蒸馏水洗至无醇味，备用[7]。

2.2.3 树脂型号的确定 分别取“2.2.1”项下粗提物干膏1.0 g各3份，精密称定，每份加无水乙醇2 mL溶解，加水稀释至10 mL，摇匀，分别加入40 mL（相当于16.0 g干树脂）3种预处理的树脂，搅匀，静态吸附12 h后抽滤，取滤液，在275 nm波长处，以甲醇为空白，测定吸光度，计算浓度。按照吸附率计算公式，计算3种树脂的吸附率。然后将上述抽滤后得到3种树脂，分别加入70%乙醇至50 mL，振荡12 h，抽滤，取滤液，于275 nm波长处测定吸光度，计算浓度。按照解吸率计算公式，计算3种树脂的解吸率。吸附率（%）＝（C0－Ct）/C0×100%；解吸率（%）＝Cj/（C0－Ct）×100%。C0为样品液的初始质量浓度，Ct为吸附后样品液的质量浓度，Cj为解吸附后滤液的质量浓度[8]。结果D-101、AB-8、DM-301型树脂的吸附率分别为81.19%、79.32%、77.64%，解吸率分别为68.15%、91.31%、87.40%。综合考虑3种树脂的吸附率和解吸率，结果发现AB-8型树脂的吸附率与解吸率均良好，故采用AB-8型大孔吸附树脂用于纯化肉豆蔻总木脂素。

2.2.4 洗脱剂浓度筛选 分别取“2.2.1”项下粗提物干膏1.0 g各3份，精密称定，每份加无水乙醇2 mL溶解，加水稀释至10 mL，摇匀，分别加入40 mL（相当于16.0 g干树脂）预处理的AB-8型树脂，搅匀，静态吸附12 h，上柱，以2 BV/h（1 BV为40 mL）的流速，依次用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，每次洗脱至无色后，更换洗脱剂浓度，洗脱液分别回收乙醇，浓缩，50 ℃减压干燥至恒重，按“2.1.3”项下方法分别测定吸光度，计算总木脂素含量。结果各洗脱液中总木脂素含量分别为0.96、85.90、114.84、2.51 mg。由结果可知，30%乙醇几乎不能洗脱出木脂素，50%与70%乙醇均能洗脱出大量木脂素，而90%乙醇洗脱出的木脂素含量明显减少，故选择先用30%乙醇洗脱无色后，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液。

2.2.5 加药量考察 取“2.2.1”项下粗提物干膏0.5、1.0、1.5 g，分别精密称定，每份加无水乙醇2 mL溶解，加水稀释至10 mL，摇匀，分别加入40 mL（相当于16.0 g干树脂）预处理的AB-8型树脂，搅匀，静态吸附12 h，上柱，以2 BV/h的流速，先用30%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱至无色，回收乙醇，浓缩，50 ℃减压干燥至恒重，按“2.1.3”项下方法分别测定吸光度，计算总木脂素含量及洗脱率。结果洗脱率分别为72.8%、71.2%、66.2%，表明在加药量为0.5 g和1.0 g时洗脱率变化不大，而加药量为1.5 g时，洗脱率下降为66.2%，故选择AB-8型树脂在40 mL时加药量为1.0 g。即上样液浓度为0.1 g/mL（按干膏量计），上样量为10 mL。

2.2.6 洗脱剂用量考察 取“2.2.1”项下粗提物干膏1.0 g，精密称定，加无水乙醇2 mL溶解，加水稀释至10 mL，摇匀，加入40 mL（相当于16.0 g干树脂）预处理的AB-8型树脂，搅匀，静态吸附12 h，上柱，以2 BV/h的流速，先用30%乙醇洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，分别在洗脱100、200、300、400、500 mL时接取洗脱液10 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，适当稀释后按“2.1.3”项下方法分别测定吸光度，计算10 mL中总木脂素含量。结果分别为6.8、8.7、0.57、0.14、0.041 mg，表明在洗脱200 mL时，洗脱液中仍然含有大量木脂素类成分，洗脱300 mL后，洗脱液中的总木脂素含量明显下降。因此，洗脱剂的最佳用量为300 mL。

2.2.7 验证试验 按上述优化的纯化工艺参数，分别取“2.2.1”项下粗提物干膏1.0 g各3份，精密称定，每份加无水乙醇2 mL溶解，加水稀释至10 mL，摇匀，分别加入40 mL（相当于16.0 g干树脂）预处理的AB-8型树脂，搅匀，静态吸附12 h，上柱，以2 BV/h的流速，先用30%乙醇洗脱至无色，再用300 mL 70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，50 ℃减压干燥至恒重，得纯化后的干膏，分别按“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算总木脂素含量。结果3批样品总木脂素含量分别为45.42%、46.94%、44.9%，平均含量为45.78%。表明工艺稳定、重复性好，可用于肉豆蔻总木脂素的纯化。

2.3 总木脂素抗炎活性研究

2.3.1 药物溶液的配制 按纯化后干膏折算的原药材量及小鼠口服给药的等效剂量，计算配制浓度。取经AB-8型树脂纯化的肉豆蔻总木脂素适量，精密称定，加2%聚山梨酯80，用超声波细胞破碎机超声分散，分别配制成浓度为4.55、9.1、18.2 mg/mL的肉豆蔻总木脂素混悬液，作为低、中、高剂量。

2.3.2 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抗炎作用 取SPF级KM小鼠50只，随机均分为模型组、阳性药组及肉豆蔻总木脂素低、中、高剂量组，每组10只。适应性喂养2 d后，各组均按0.2 mL/20 g给药，实验期间自由饮水。空白组灌胃给予2%聚山梨酯80，阳性药组灌胃给予阿司匹林（0.8 mg/mL）混悬液，肉豆蔻总木脂素低、中、高剂量组按“2.3.1”项下相应浓度混悬液灌胃给药，1次/d，连续5 d。末次给药1 h后，将0.05 mL二甲苯均匀涂抹在各组小鼠右耳廓的正反两面，以不涂二甲苯的左耳为对照。致炎肿胀后1 h，将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下左、右两耳，分别在耳廓同一部位用打孔器打下两耳片，精密称定，以左、右耳质量差为耳肿胀度[9]，以耳肿胀度为评价指标，计算抑制率[（空白组肿胀度－给药组肿胀度）÷空白组肿胀度×100%][10]，结果见表1。与模型组比较，阳性药组及总木脂素低、中、高剂量组肿胀度差异均有统计学意义（＜0.01）；与阳性药组比较，总木脂素低、中剂量组差异均有统计学意义（＜0.01），高剂量组无明显差异（＞0.05）；总木脂素低、中、高剂量组随给药剂量的增加，抗炎作用依次增强，其高剂量组抗炎作用与阳性药组相当，表明肉豆蔻总木脂素具有抗炎作用。

表1 肉豆蔻总木脂素对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响（±s）

注：与模型组比较，**＜0.01；与阳性药组比较，##＜0.01

3 讨论

由于肉豆蔻中含有大量脂肪油和挥发油，木脂素类成分含量较低且难溶于水，因此，在粗提物制备过程中，将醇提液置于-20 ℃冰箱中制冷的作用主要是使脂肪油大量析出，趁冷可以滤除；回收醇后浓缩至约200 mL，再加水稀释至400 mL，搅匀后离心的目的主要是去除挥发油及水溶性成分，沉淀物再经乙酸乙酯萃取后，可提高总木脂素类成分的含量，便于大孔吸附树脂的纯化。

肉豆蔻中总木脂素的含量大约为0.9%～2.2%，对于肉豆蔻总木脂素的纯化研究，试验中曾考虑采用醇提后制冷，再用乙酸乙酯萃取，但总木脂素的含量只能达到25%左右，为进一步提高总木脂素的纯度，试验在原有粗提物制备方法的基础上，又采用了大孔吸附树脂纯化技术，使总木脂素的含量达到45%左右。但如要使其纯度达到50%以上，还需进一步深入研究。

抗炎作用实验研究中，动物模型采用二甲苯致小鼠耳肿胀法，通过二甲苯使小鼠耳廓毛细血管的通透性增加，达到诱导小鼠耳廓肿胀的目的。

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Study on Purification and Anti-inflammatory Effects of Total Lignans in Myristicae Semen

ZHANG Hui1, WANG Jing2, YUAN Zi-min2, HU Na2

Objective To optimize purification technology of total lignans in Myristicae Semen; To study its anti-inflammatory effects. Methods Macroporous adsorption resin was used for enrichment and purification of total lignans in Myristicae Semen, with adsorption rate, desorption rate and content of total lignans as indexes. The resin type, concentration of eluent, sample weight and dosage of eluen were investigated. Anti-inflammatory effects were studied by determining swelling degree and inhibition rate of mice with ear swelling induced by xylene.Results Purification technology of total lignans was processed on type of AB-8 resin. 1 g crude extract was dissolved as sample; 40 mL preprocessed resin including 16 g resin was added and static adsorpted for 12 hours; 30% ethanol was used firstly to elute to colorless and then 300 mL 70% ethanol was used to elute; the eluent of 70% ethanol was collected. The purity of total lignans was 45.8%. There was statistical significance in ear swelling degree of total lignans in Myristicae Semen high-, medium-, and low-dosage groups compared with model group (<0.05). Conclusion The purification technology of total lignans is stable and reproducible, and total lignans in Myristicae Semen has significant anti-inflammatory activity.

Myristicae Semen; total lignans; anti-inflammatory effects; macroporous adsorption resin

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.021

R284.2；R285.5

A

1005-5304(2017)06-0083-04

国家自然科学基金面上项目（81274084）；辽宁省科学技术计划（201602511）

袁子民，E-mail：yuanzmin@163.com

（2016-10-14；编辑：陈静）