HPLC法同时测定连花柴芩可溶性粉中4种有效成分含量

张丽先，魏悦，曹静亚，王志尧，王学方，李晓*

(1. 河南科高中标检测技术有限公司，郑州 450002; 2. 河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司，郑州 450002)



HPLC法同时测定连花柴芩可溶性粉中4种有效成分含量

张丽先1，魏悦1，曹静亚1，王志尧2，王学方2，李晓2*

(1. 河南科高中标检测技术有限公司，郑州 450002; 2. 河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司，郑州 450002)

建立了HPLC法同时测定连花柴芩可溶性粉中绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷的含量。采用Venusil XBP C18分析柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈～0.1%磷酸水为流动相，1.0 mL/min的流速下进行梯度洗脱，320 nm波长处对4种成分进行含量测定。结果表明，在此色谱条件下，4种组分分离度良好，分别在3.28～26.24 μg/mL、3.17～25.36 μg/mL、6.08～48.64 μg/mL及8.81～70.48 μg/mL范围内线性关系良好，加样回收率均大于96.61 %，RSD均小于1.75 %。该方法简便、快速、准确，重复性良好，可用于连花柴芩可溶性粉中绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷的同时测定。

连花柴芩可溶性粉；含量测定；高效液相色谱法

连花柴芩可溶性粉是针对禽病毒性呼吸道疾病、以“清热解毒、宣肺止咳”为治疗原则，通过临床筛选、科学组方，研制的纯中药制剂，由连翘、山银花、柴胡、黄芩、甘草等药味组成。前期研究表明，连花柴芩可溶性粉具有明显的抗炎解热、止咳祛痰以及免疫增强等作用[1-2]，临床用于畜禽病毒性呼吸道疾病的预防和治疗，效果良好。连花柴芩可溶性粉药味众多，成分复杂，建立可靠的方法对其进行质量控制势在必行，多指标含量测定质量控制体系在增加复方制剂质量可控性、保证产品质量、确保制剂稳定性、安全性及有效性方面具有重要现实意义[3]，本试验采用高效液相方法对连花柴芩可溶性粉中4种有效成分的含量进行同时测定，为该产品的质量可控性提供了重要的技术依据，以期为进一步建立其质量标准提供重要参考。

1 材 料

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪(包括CMA-20A系统、LC-20AT二元高压泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A检测器、LC Soulation工作站)，ME204梅特勒电子天平，岛津AUW 220D十万分之一天平，昆山KQ-500超声仪。

1.2 试剂与样品 3批连花柴芩可溶性粉(由河南科高植物天然产物开发工程技术有限公司提供，批号为20140324、20140325、20140326)。绿原酸对照品(批号为110753-200413)、甘草苷对照品(批号为111610-201106)、连翘酯苷A对照品(批号为111810-201001)、黄芩苷对照品(批号为110715-200815)，均购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈(色谱纯)，磷酸(分析纯)，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸5.12 mg，甘草苷4.96 mg，连翘酯苷A 9.50 mg，黄芩苷13.76 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为102.4 μg/mL绿原酸，99.2 μg/mL甘草苷，190 μg/mL连翘酯苷A和275.2 μg/mL黄芩苷的混合对照品储备液，精密移取上述储备液3.2 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为32.77 μg/mL绿原酸，31.74 μg/mL甘草苷，60.8 μg/mL连翘酯苷A和88.06 μg/mL黄芩苷的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备方法 取本品0.2 g，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇，定容摇匀，超声处理30 min，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm膜，得供试品溶液。

2.3 色谱条件 Venusil XBP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(B)～0.1%磷酸水溶液(A)为流动相，梯度洗脱程序为：0～10 min 9%～13.5% B，10～13 min 13.5%～16.2% B，13～25 min 保持16.2% B，25～27 min 16.2%～19.8% B，27～32 min 19.8%～21.6% B，32～38 min 21.6%～31.5% B，38～40 min 31.5%～36% B，40～55 min 36%～45.9% B，55～60 min 45.9%～75% B；流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为320 nm，进样量为10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 精密移取1、2、4、6、8 mL的混合对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度。按2.3项色谱条件分别进样，记录色谱图(图1)，以峰面积 (y)对进样浓度(x)进行线性回归，得到4种有效成分的线性回归方程(表1)。

2.4.2 精密度考察 取同一混合对照溶液，连续重复进样6次，记录峰面积，并计算相对标准偏差(RSD)。绿原酸的RSD为0.64%，甘草苷的RSD为1.26%，连翘酯苷A的RSD为0.89%，黄芩苷的RSD为0.92%，表明仪器精密度良好，满足检测需要。

图1 混合对照品的HPLC色谱图 (1：绿原酸，2：甘草苷，3：连翘酯苷A，4：黄芩苷)Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(1. chlorogenic acids, 2. liquiritin, 3. forsythoside A, 4. baicalin)

成分名称保留时间/min标准曲线线性范围/(μg·mL-1)相关系数R2绿原酸11.621y=31921x-56783.28～26.240.9999甘草苷24.417y=6636x+993.17～25.360.9998连翘酯苷A26.146y=14754x-43436.08～48.640.9999黄芩苷41.790y=23201x+151988.81～70.480.9999

2.4.3 重复性考察 取20140324批次连黄柴芩粉，按2.2项平行制备供试品溶液6份，分别按2.3项中色谱条件测定绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A和黄芩苷含量。结果绿原酸的含量分别为3.82、3.79、3.85、3.81、3.86、3.88 mg/g，甘草苷的含量为1.03、1.06、1.02、1.06、1.05、1.02 mg/g，连翘酯苷A含量为3.28、3.19、3.31、3.26、3.28、3.35 mg/g，黄芩苷含量为14.42、14.45、14.35、14.28、14.37、14.49 mg/g，RSD分别为0.88%、1.82%、1.63%、0.52%，RSD均小于1.82 %，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性考察 取同一份供试品溶液，分别于配制完成后0、4、8、12、24 h进样1次，记录峰面积。结果绿原酸峰面积的RSD为1.98%，甘草苷峰面积的RSD为1.65%，连翘酯苷A 峰面积的RSD为1.24%，黄芩苷峰面积的RSD为0.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率 准确称取同一已测知含量的连花柴芩可溶性粉样品6份，各0.1 g，置于50 mL量瓶中，分别准确加入相应量的绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷对照品溶液，加50%甲醇至刻度，摇匀，超声30 min，放冷，定容并摇匀，过0.45 μm滤膜，得加样回收率供试品溶液，进行含量测定，计算加样回收率及RSD，结果见表2～表5。绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷平均回收率分别为97.44%、96.91%、96.61%、98.61%，RSD分别为1.52%、1.18%、1.75%、1.67%，结果表明该方法准确度良好。

2.4.6 专属性考察 取按2.2项方法分别制备的连花柴芩可溶性粉去除山银花、甘草、连翘、黄芩的阴性供试液，上述色谱条件下分别进样分析(图2)，从图中箭头指向的相应目标物出峰处可看出，山银花、甘草、连翘、黄芩阴性供试液分别在绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A、黄芩苷出峰处无干扰，表明该方法可以用于4种有效成分定量。

2.5 样品测定 取批号为20140324、20140325、20140326的3批连花柴芩可溶性粉，分别按2.1项制备3份平行供试品溶液，按上述方法进行含量测定，HPLC色谱图见图3，外标法计算绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷的含量，并计算其RSD，结果见表6，RSD值均小于2.0%。

表2 绿原酸加样回收试验结果(n=6)Tab 2 Recovery results of chlorogenic acids (n=6)

表3 甘草苷加样回收试验结果Tab 3 Recovery results of liquiritin (n=6)

表4 连翘酯苷A加样回收试验结果Tab 4 Recovery results of forsythoside A(n=6)

表5 黄芩苷加样回收试验结果Tab 5 Recovery results of baicalin (n=6)

图2 阴性对照HPLC色谱图(a. 山银花阴性，b.甘草阴性，c. 连翘阴性，d. 黄芩阴性)Fig 2 HPLC chromatograms of negative control. (a. Lonicera confusa negative control, b.Glycyrrhiza uralensis negative control, c. fructus forsythiae negative control, d. Scutellaria baicalensis negative control)

图3 连花柴芩可溶性粉HPLC色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of Lian-hua-chai-qin soluble power

批号绿原酸甘草苷连翘酯苷A黄芩苷含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%201403243.841.521.041.863.280.9214.400.68201403255.600.671.521.695.261.3415.011.16201403268.400.791.961.787.241.2021.701.48

3 讨论与小结

3.1 测定成分的选择 复方制剂的药效是多组分共同作用的结果，单一成分的含量不能整体综合的反映复方制剂的质量[4]，在选择定量指标时综合考虑连花柴芩可溶性粉所含的活性成分、君药的特征成分等特点[5-6]，有针对性的选择了绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A、黄芩苷4个指标成分，以多方面监控连花柴芩可溶性粉的质量。

3.2 样品前处理方法的选择 提取方法的选择，考察了回流法和超声法，鉴于回流法操作烦琐，且绿原酸受热不稳定[7]，采用操作简便的超声法。对比了30%甲醇、50%甲醇和纯甲醇为提取溶剂以及10、20、30 min超声时间对4目标分析物的提取效率，结果以50%甲醇为溶剂，超声30 min效果最好。

3.3 检测波长的选择 由4种目标成分的紫外图谱可得，绿原酸的最大吸收在326 nm，连翘酯苷A最大吸收波长为328 nm，甘草苷最大吸收在276 nm处，次吸收波长在312 nm，黄芩苷在277 nm处有最大吸收，次吸收在317 nm，综合考虑色谱峰响应值及分离度，最终选择320 nm作为检测波长。

3.4 流动相的选择 基于绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷自身的酸碱性，酸性环境中3种组分良好的稳定性能[7-9]，以及磷酸对甘草苷良好的分离效果[10]，本试验分别考察了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水以及不同比例磷酸对指标成分分离度的影响。以甲醇为有机相色谱峰基线不平稳，对于指标成分的准确定量有影响，以乙腈为有机相可避免此问题；分别考察了0.05%、0.1%、0.2%、0.5%磷酸水溶液对色谱峰的分离效果，发现0.1%、0.2%磷酸下4指标成分的分离度、色谱峰对称性较好，考虑到色谱柱对大比例酸的耐受能力较弱，选择0.1%磷酸水；最终流动相选择乙腈-0.1%磷酸水。

本试验建立了同时测定连花柴芩可溶性粉中绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷含量的HPLC方法，该方法准确、简便，重复性好，为控制连花柴芩可溶性粉质量，确保产品批次间稳定性，建立其质量标准提供重要参考，同时该方法可进一步用于含相同药味的其他复方制剂中绿原酸、甘草苷、连翘酯苷A及黄芩苷的定性定量检测。

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(编辑：侯向辉)

Simultaneous Determination of Four Active Components in Lian-hua-chai-qin Soluble Power by HPLC

ZHANG Li-xian1, WEI Yue1,CAO Jing-ya1, WANG Zhi-yao2, WANG Xue-fang2, LI Xiao2*

(1. Cogotesting International Company Limited, Zhengzhou 450000, China;2. Henan Plant Natural-Products Development Engineering Technology Company, Zhengzhou 450002, China)

LI Xiao E-mail: 67430218@qq.com

A new HPLC method was firstly established for simultaneous determination of caffeotannic acid,

liquiritin, forsythoside A and baicalin in Lian-hua-chai-qin soluble power. Analysis was performed on a venusil XBP C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was considered of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution, the flow rate set at 1.0 mL/min and the detected wavelength was 320 nm. Results showed four substances were separated effectively, caffeotannic acid, liquiritin, forsythoside A and baicalinin had good linearity over the range of 3.28～26.24 μg/mL, 3.17～23.36 μg/mL, 6.08～48.64 μg/mL and 8.81～70.48 μg/mL, respectively. The average recoveries were higher than 96.61% andRSDall below 1.75%. The method is accurate, rapid and repeatable, can be used for simultaneous determination of caffeotannic acid, liquiritin, forsythoside A and baicalin in Lian-hua-chai-qin soluble power.

Lian-hua-chai-qin soluble power; content determination; HPLC

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.06

河南省科技攻关项目(152102110115)

张丽先，硕士，从事中药质量控制研究。

李晓。E-mail: 67430218@qq.com

2016-11-25

A

1002-1280 (2017) 05-0027-06

S859.2