miR-204对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学特性的影响*

吴刘成，杜利莉，王 静，殷海琳，马 超，蒋茂荣，邵义祥△

(1 南通大学杏林学院，江苏南通 226009；2 南通大学实验动物中心，江苏南通 226001)

miR-204对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学特性的影响*

吴刘成1，2，杜利莉1，王 静1，殷海琳1，马 超1，蒋茂荣2，邵义祥2△

(1 南通大学杏林学院，江苏南通 226009；2 南通大学实验动物中心，江苏南通 226001)

目的 研究microRNA-204(miR-204)对乳腺癌细胞生物学特性的影响。方法 在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染miR-204模拟物和抑制剂后48 h，实时荧光PCR(Real-time PCR)检测细胞中miR-204表达变化。流式细胞仪分析miR-204对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的影响。采用Transwell迁移小室分析法检测miR-204对MDA-MB-231细胞迁移的影响。结果 实时荧光PCR分析：miR-204模拟物和抑制剂效果显著，与正常对照比较差异有统计学意义(P<0.01)；流式细胞仪分析：与正常对照相比，miR-204 模拟物组G1期细胞数目明显减少(P<0.01)，G2/M期细胞数目明显增多(P<0.01)，而miR-204 抑制剂的作用则相反，G1期细胞数目明显增多(P<0.01)，G2/M期细胞数目明显减少(P<0.01)；miR-204模拟物组明显促进细胞凋亡(P<0.01)，而抑制剂组明显抑制细胞凋亡(P<0.01)。Transwell迁移小室分析：miR-204 模拟物组穿过Transwell迁移小室的细胞明显减少(P<0.01)，而抑制剂组则相反，细胞数目明显增多(P<0.01)。结论 miR-204对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有负调控作用，能够抑制乳腺癌细胞增殖和迁移，促进癌细胞凋亡。

乳腺肿瘤；细胞凋亡；微RNAs；miR-204；MDA-MB-231；细胞生物学特性

乳腺癌是严重危害生命健康的恶性肿瘤之一，是女性第2位最常见的恶性肿瘤[1]，且乳腺癌的发病率和病死率呈逐年增长趋势[2]。目前，已经有开发相关的靶向药物用于临床治疗，但疗效并不乐观，分子靶向治疗被认为是一种有效途径[3]。微小RNA(miRNA)的出现为研究乳腺癌的发病机制提供了新的策略和思路。有研究发现miRNA-204(miR-204)过表达则可抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力[4]。显然miR-204对肿瘤细胞具有抑制作用，而在乳腺癌中研究的还比较少。因此，本试验构建miR-204的模拟物及抑制剂，并转染作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞，研究对该细胞的行为学变化，以期为乳腺癌的靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 使用人乳腺癌MDA-MB-231细胞系，由南通大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要仪器与试剂 CO2培养箱(Thermo公司，美国)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，中国)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；流式细胞仪(BD公司，美国)；ABI stepone 实时荧光PCR (Real-Time PCR) System (ABI公司，美国)；低温冷冻离心机 (Eppendorf公司，德国)。1640培养基，胎牛血清(HyClone公司，美国)；Trizol (Invitrogen公司，美国)；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒，Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(碧云天生物科技公司，中国)；riboFECTTMCP 转染试剂盒(广州锐博生物科技有限公司，中国)；SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR(Roch公司，瑞士)；Omniscript®Reverse Transcription kit (Qiagen公司，德国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏及培养 按照常规的细胞冻融方法操作，以缓冻速溶为原则，将冻存细胞从-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃的水浴，使其快速融化，之后加入完全培养基。放入CO2培养箱，第2天更换培养基，每隔1～2天或者培养基变为黄色时更换培养基。

1.2.2 miR-204转染细胞方法 转染前1 d细胞接种至6孔板中，密度为1×105，采用含有10%胎牛血清(FBS)的1640培养基培养细胞，使转染时的细胞密度能够达到50%～80%。细胞转染按照riboFECTTMCP 转染试剂盒说明书进行操作。试验设置4个组：正常对照组加入500 μL的磷酸盐缓冲液(PBS)；阴性对照组加入阴性对照mimic及riboFECTTMCP Reagent；抑制剂组加入miR-204抑制剂及riboFECTTMCP Reagent；模拟物组加入miR-204 mimic及riboFECTTMCP Reagent。之后将6孔板放入CO2培养箱中培养48 h。

1.2.3 Real-time PCR检测miR-204表达水平 本试验检测miR-204采用U6作为内参，其中RT反应中的颈环引物和Real-time PCR反应中的颈环引物，均由广州锐博生物有限公司设计并合成。细胞总RNA提取。转染48 h，然后弃掉培养基，使用预冷PBS缓冲液洗2次；6孔板中加入1.0 mL Trizol，水平放置片刻；用枪头吹打几次，转入1.5 mL EP管中，反复吹打至无明显沉淀；室温孵育5 min；加入0.2 mL三氯甲烷；涡旋振荡器上震荡15 s；室温孵育5 min；4 ℃,12 000 r/min,15 min；吸取大约0.5 mL上清液；加入0.5 mL异丙醇，上下颠倒混匀；室温孵育10 min；4 ℃，12 000 r/min，10 min；弃去上清液；加入1.0 mL 75%乙醇；轻微混匀，4 ℃,7 500g,5 min，弃去上清液；重复上一步骤；静置5～10 min，晾干；用RNase-free水重悬；55～60 ℃水浴10～15 min，超微量分光光度计测定核酸浓度。PCR反应体系及条件：RNA template (2 μg),Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer(62.5 nmol/L) 2.0 μL，加RNase-free water至14 μL,以上体系混匀后，瞬时离心，70 ℃放置10 min后，再加入以下试剂进行RT反应，10×Buffer RT 2 μL，dNTP Mix (5 mmol/L each dNTP) 2 μL，RNase 抑制剂 (10 U/μL) 1 μL，Omniscript Reverse Transcriptase 1 μL，total reaction volume 20 μL，瞬时离心，37 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，于-20 ℃保存。Real-time PCR反应体系及条件。20 μL 反应体系：2×SYBGreen Master Mix 10 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Forward Primer (5 μmol/L) 2 μL，Bulge-LoopTMmiRNA Reverse Primer (5 μmol/L) 2 μL，cDNA 2 μL,加ddH2O 至20 μL。试剂混匀后短暂离心置于ABI stepone Real-time PCR 仪，程序如下：95 ℃ 5 min；(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s收集荧光)×45；55.0～90.0 ℃每上升0.3 ℃读荧光值生成熔解曲线。每个PCR反应设置3个复孔，扩增结束后，根据扩增曲线和熔解曲线分析扩增效率和特异性，并得到各反应管的循环阈值(Ct)，miR-204的相对表达量采用2-△△Ct方程进行计算。

1.2.4 细胞增殖和凋亡检测方法 分别在6孔板中转染试剂48 h后，按照碧云天生物科技公司试剂盒说明书操作，并用流式细胞仪检测。

1.2.5 细胞迁移检测方法 在6孔板中细胞转染试剂48 h后，更换为基础培养基，饥饿24 h，收集细胞，PBS洗涤再重悬，向Transwell上室中加入200 μL细胞悬液(2×105)，下室中加入500 μL完全培养基，参照文献[5]操作。

2 结 果

2.1 miR-204 抑制剂和模拟物转染效率的检测 4组转染效率比较差异有统计学意义(F=198.9，P=0.000)。与正常对照组相比，阴性对照组miR-204表达水平率略有上升，但比较差异无统计学意义(t=2.637，P=0.062)；抑制剂组miR-204水平明显下降(t=11.60，P=0.000)；模拟物组miR-204水平明显上升(t=14.10，P=0.0000)，见图1。

图1 4组miR-204表达水平

A:正常对照组；B:阴性对照组；C:抑制剂组；D:模拟物组。

图2 细胞流式术检测各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖

2.2 细胞流式术检测人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖 G1期、S期及G2/M期，3个时期中的4组百分比细胞计数的均数差异有统计学意义(FG1期=106.98，FS期=25.80，FG2/M期=28.24，P<0.01)。G1期：与正常对照组相比，阴性对照组细胞数目增多，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，抑制剂组细胞数目明显增多(P<0.01)，模拟物组细胞数目明显减少(P<0.01)。S期：与正常对照组相比，阴性对照组细胞数目减少，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，抑制剂组细胞数目明显减少(P<0.01)，模拟物组细胞数目略有增多，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。G2/M期：与正常对照组相比，阴性对照组细胞数目增多，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，抑制剂组细胞数目明显减少(P<0.01)，模拟物组细胞数目明显增多(P<0.01)，见图2、3。

图3 miR-204对各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞周期的影响

2.3 细胞流式术检测人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡 4组百分比细胞凋亡计数的均数比较差异有统计学意义(F=118.3，P<0.01)。与正常对照组相比，阴性对照组细胞凋亡数目减少，但比较差异无统计学意义(t=2.267，P=0.086),抑制剂组细胞凋亡数目明显减少(t=12.77，P<0.01)，模拟物组细胞凋亡数目明显增多(t=7.086，P<0.01)，见图4、5。

A:正常对照组；B：阴性对照组；C：抑制剂组；D：模拟物组。

图4 细胞流式术检测各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡

图5 miR-204 对各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

2.4 Transwell小室试验检测人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力 4组迁移细胞数目的均数比较差异有统计学意义(F=60.77，P<0.01)。与正常对照组相比，阴性对照组细胞迁移数目增多，但比较差异无统计学意义(t=1.011，P=0.369)，抑制剂组细胞迁移数目增多(t=6.411，P<0.01)，模拟物组细胞迁移数目减少(t=7.115，P<0.01)，见图6、7。

A:正常对照组；B：阴性对照组；C：抑制剂组；D：模拟物组。

图6 Transwell小室检测各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移

图7 miR-204 对各组人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响

3 讨 论

miRNA是一种非编码小RNA分子(约含22个核苷酸)，存在于植物、动物和一些病毒中，功能主要是RNA沉默和转录后修饰调控基因表达[6]。成熟的miRNA是RNA诱导沉默复合体(RISC)的重要组成部分，该沉默复合体还包括核糖核酸酶和许多相关的蛋白质[7]。miR-204定位于人类第9号染色体73424891和73425000位之间。有研究表明miR-204在肿瘤组织中存在异常表达，并与肿瘤增殖[8]、侵袭转移[9]、化疗抵抗[10]及不良预后[11]密切相关。然而，miR-204在不同的肿瘤中起着不同的作用。比如，miR-204在急性淋巴白血病[12]和前列腺癌[13]肿瘤中高表达，起癌基因作用，促进肿瘤的增殖和转移。而在鼻咽癌[9]和子宫内膜癌[10]等肿瘤中表达下调，起抑癌基因作用，抑制肿瘤的发展。

本研究结果显示，miR-204促进乳腺癌细胞凋亡，与Wang 等[14]报道的结果一致，抑制细胞的增殖，这与Xiong等[15]报道的结果相似，抑制细胞的迁移能力，这与Imam等[16]等报道的结果相似。研究结果提示，miR-204在乳腺癌细胞中起抑癌基因的作用，能够抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移并促进其凋亡，具有作为诊治乳腺癌分子靶标的潜能。但是miR-204调控乳腺癌增殖和转移的具体机制还不是很清楚，还有待于更进一步的研究。总之，miR-204可能在乳腺癌的发生、发展及治疗过程中发挥重要作用，靶向miR-204治疗也可能为乳腺癌的治疗提供新思路。

[1]张敏璐，黄哲宙，郑莹．中国2008年女性乳腺癌发病、死亡和患病情况的估计及预测[J]．中华流行病学杂志，2012，33(10)：1049-1051．

[2] Kantelhardt EJ,Cubasch H,Hanson C.Taking on breast cancer in East Africa:global challenges in breast cancer[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2015,27(1):108-114.

[3]范雅文，张旭辉，张嵘，等．三阴乳腺癌的异质性及靶向治疗[J]．生物技术通讯，2015，26(3)：442-445

[4]Ying Z,Li Y,Wu J,et al.loss of miR-204 expression enhances glioma migration and stem cell-like phenotype[J].Cancer Res,2013,73(2):990-999.

[5]Yi M,Li M,Long X,et al.miR-520e regulates cell proliferation,apoptosis and migration in breast cancer[J].Oncol Lett,2016,12(5):3543-3548.

[6]Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004,431(7006):350-355

[7]Rana TM.Illuminating the silence:understanding the structure and function of small RNAs[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(1):23-36.

[8]Mikhaylova O,Stratton Y,Hall D,et al.VHL-regulated MiR-204 suppresses tumor growth through inhibition of LC3B-mediated autophagy in renal clear cell carcinoma[J].Cancer Cell,2012,21(4):532-546.

[9]Vimalraj S,Miranda PJ,Ramyakrishna B,et al.Regulation of breast cancer and bone metastasis by microRNAs[J].Dis Markers,2013,35(5):369-387.

[10]Ryan J,Tivnan A,Fay J,et al.MicroRNA-204 increases sensitivity of neuroblastoma cells to cisplatin and is associated with a favourable clinical outcome[J].Br J Cancer,2012,107(6):967-976.

[11]Zeng L,Yu J,Huang T,et al.Differential combinatorial regulatory network analysis related to venous metastasis of hepatocellular carcinoma[J].BMC Genomics,2012,13 Suppl 8:S14.

[12]Kovaleva V,Mora R,Park YJ,et al.miRNA-130a targets ATG2B and DICER1 to inhibit autophagy and trigger killing of chronic lymphocytic leukemia cells[J].Cancer Res,2012,72(7):1763-1772.

[13]Boll K,Reiche K,Kasack K,et al.MiR-130a,miR-203 and miR-205 jointly repress key oncogenic pathways and are downregulated in prostate carcinoma[J].Oncogene,2013,32(3):277-285.

[14]Wang X,Qiu W,Zhang G,et al.MicroRNA-204 targets JAK2 in breast cancer and induces cell apoptosis through the STAT3/BCl-2/survivin pathway[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):5017-5025.

[15]Xiong F,Liu K,Zhang F,et al.MiR-204 inhibits the proliferation and invasion of renal cell carcinoma by inhibiting RAB22A expression[J].Oncol Rep,2016,35(5):3000-3008.

[16]Imam JS,Plyler JR,Bansal H,et al.Genomic loss of tumor suppressor miRNA-204 promotes cancer cell migration and invasion by activating AKT/mTOR/Rac1 signaling and actin reorganization[J].PLoS One,2012,7(12):e52397.

Effect of miR-204 in cell biological characteristics of breast cancer MDA-MB-231 cell*

WuLiucheng1，2，DuLili1，WangJing1，YinHailin1，MaChao1，JiangMaorong2，ShaoYixiang2△

(1.XinglinCollege，NantongUniversity，Nantong，Jiangsu226009，China；2.LaboratoryAnimalsCentre，NantongUniversity，Nantong，Jiangsu226001，China)

Objective To study the effect of microRNA-204 (miR-204) on the biological characteristics of breast cancer cells.Methods Real-time PCR was used to detect the expression of miR-204 in human breast cancer cell MDA-MB-231 after transfection of miR-204 mimics and inhibitor for 48 h.Flow cytometry was used to analyse the effect of miR-204 on the proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells.The effect of miR-204 on the migration of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell migration assay.Results Real-time PCR analysis showed that miR-204 mimics and inhibitors had significant effect compared with normal control group(P<0.01).Flow cytometry analysis showed that compared with normal control group，the number of G1phase cells of miR-204 mimics group was significantly decreased(P<0.01),while the number of G2/M cells of miR-204 mimics group was significantly increased(P<0.01).In contrast,the number of G1phase cells of miR-204 inhibitor group was significantly increased(P<0.01),while the number of G2/M cells of miR-204 inhibitor group was significantly decreased(P<0.01).miR-204 mimics group significantly promoted apoptosis,while the inhibitor group significantly inhibited apoptosis(P<0.01).Transwell migration analysis showed that the number of cells of miR-204 mimics group were significantly reduced,while the number of cells was significantly increased in the inhibitor group(P<0.01).Conclusion We find miR-204,which can promote cell apoptosis and inhibit cell proliferation and migration,is a negative factor in the breast cancer cell line MDA-MB-231.

breast neoplasms;apoptosis;MicroRNAs;miR-204;MDA-MB-231;cell biological characteristics

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.004

江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201513993009Y)。 作者简介：吴刘成(1980-)，实验师，硕士，主要从事人类疾病动物模型方面研究。△

，E-mail:shaoyx@ntu.edu.cn。

Q291

A

1671-8348(2017)14-1881-04

2016-11-23

2017-01-11)