清脑和血方治疗大鼠脑胶质瘤的药效作用及其初步机制研究

徐燕芳 卞银燕 王天游 俞文华 董晓巧

清脑和血方治疗大鼠脑胶质瘤的药效作用及其初步机制研究

徐燕芳1卞银燕2王天游2俞文华3董晓巧3

目的观察清脑和血方对大鼠脑胶质瘤的药效作用，并初步探讨其作用机制。方法Wistar大鼠45只，采用脑立体定位注射鼠源性C6胶质瘤细胞（C6细胞）建立大鼠胶质瘤模型；将成模大鼠随机分为模型组、顺铂组、清脑和血方组，每组10只；另设10只大鼠为空白对照组。连续给药25天，检测各组大鼠血清白细胞介素（IL）-2、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ水平；依次剥离脑组织与胶质瘤组织，称重，计算瘤重占脑组织重百分比；HE染色观察胶质瘤组织病理；免疫印迹法检测胶质瘤组织中环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的表达情况。结果与模型组比较，清脑和血方组大鼠的瘤重[（0.0121±0.0050）g比（0.0779±0.0390）g]、瘤重占脑组织重百分比[（0.49±0.0075）%比（3.07±0.0176）%]、血清中IL-2[（91.14±10.33）pg/mL比（160.42±15.98）pg/mL]、IL-10[（49.58±6.79）pg/mL比（92.17±7.71）pg/mL]含量均明显降低（P＜0.01）；血清IFN-γ[（198.54± 11.83）pg/mL比（111.53±17.50）pg/mL]、TNF-α[（209.41±21.82）pg/mL比（119.00±20.21）pg/mL]含量明显升高（P＜0.01）。结论清脑和血方能够明显抑制大鼠C6胶质瘤细胞的颅内生长，其作用机制可能与调节机体免疫因子水平，抑制肿瘤相关蛋白CREB的表达有关。

大鼠；脑胶质瘤；清脑和血方；C6细胞；CREB

脑胶质瘤是最常见的神经系统肿瘤，多呈浸润性生长和恶性病变，手术难以根除，治疗十分困难[1]。恶性脑胶质瘤病死率位居所有肿瘤第三位，其平均存活时间仅为36～48周，两年生存率为8%～12%[2]，5年内生存率不足5%[3-4]。目前脑胶质瘤的临床治疗以手术切除为主，辅以化疗、放疗、免疫及基因治疗等综合治疗，但治疗效果仍不理想。化疗是脑胶质瘤治疗的重要方法之一，可以明显提高患者的平均存活率并延长生存期[5-6]。烷化剂是脑胶质瘤临床应用最广泛的化疗药物，但由于其毒副反应大，难以改善患者生存质量，仍无法满足临床需求[7]。清脑和血方由笔者在临床经典方的应用实践中总结精炼而成，由桃核承气汤合四物汤加天麻、蛇六谷、生山楂、蝉衣组成。体外实验发现该方对鼠源性C6胶质瘤细胞有一定抑制作用，但该方的体内实验尚未见报道。本实验拟采用脑立体定位注射法建立大鼠胶质瘤模型，对清脑和血方抗胶质瘤的药效作用及其机制进行初步探讨，旨在为清脑和血方的临床推广提供基础数据。

1 实验材料

1.1 动物与细胞健康SPF级雄性Wistar大鼠45只，体质量（190±10）g，购于上海西普尔必凯实验动物有限责任公司，动物生产许可证号为SCXK（沪）2013-0016；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统内，动物使用SYXK许可证号为（浙）2013-0184。室温（23±2）℃，相对湿度60%～70%，12h光照，自由饮水，标准普通饲料喂食。鼠源性C6细胞购于中国科学院上海细胞库。

1.2 药物与试剂中药均购于浙江中医药大学中药饮片厂；顺铂（江苏豪森，批号150503）；DMEM培基（Hyclone，批号NAG7440）；CREB抗体（Abcam，批号GR50483-33）；IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α ELISA试剂盒（杭州乐峰生物科技有限公司，批号CK-E306 35R）。

1.3 仪器脑立体定向仪（美国Stoelting）；微量注射器（瑞士Hamilton）；血球计数板（德国Marienfeld）；低温高速离心机（美国Beckman），AP280组织包埋机（德国Microm），HM 335E型轮转切片机（德国Microm），自动染色机（德国Leica），DMI 3000B显微镜（德国Leica），电泳仪（美国Bio-rad）。

2 实验方法

2.1 药物制备清脑和血方药物组成：桃仁15g，桂枝6g，制大黄15g，芒硝、生草各6g，当归15g，赤芍20g，川芎10g，生地40g，天麻9g，蛇六谷15g，生山楂30g，蝉衣6g。按上述比例配制，加10倍量水提取2次，每次1.5h，合并两次药液后旋蒸浓缩，得到浸膏，使用前加水配置，浓度为折合生药量4.1g/mL。

2.2 C6细胞准备C6细胞复苏后，在接种前至少传代1次，待细胞长至对数生长期时（2/3培养瓶底长满）收集细胞（于收集细胞前24h更换培养液）。收集细胞时用0.01mol/L PBS洗涤1次，再用0.25%胰酶消化，并于显微镜下观察细胞状态，待细胞收缩变圆，加入含10%血清的DMEM培养液终止消化，再加入不含血清的DMEM培养液，收集细胞，800r/min离心4min，血球计数制备2.5×107/mL细胞悬液，备用。

2.3 模型构建Wistar大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪，头部固定于立体定向架，剪去头顶部毛发并消毒种植部位。确定接种靶点后打开颅骨，用25μL微量注射器接种混匀的细胞悬液（2.5×107/mL，2.5×105个细胞/只，体积10μL），硬膜下进针3mm，退1mm，颅内注射速度为2μL/min，注射完毕留针5min后再拔针。骨孔用骨蜡封闭，缝合伤口，单笼饲养。

2.4 动物分组与给药45只雄性Wistar大鼠，分为空白对照组10只，造模组35只，造模组按照2.2与2.3中方法构建大鼠胶质瘤模型，造模过程中大鼠共死亡5只。将造模成功的30只大鼠随机分为模型对照组、顺铂组、清脑和血方组，每组10只。术后第3天开始给予药物干预：顺铂组腹腔注射顺铂稀释液0.2mL/只,剂量为1mg/（kg·d），清脑和血方组灌胃清脑和血汤剂1mL/100g,剂量为4.1g/（kg·d），模型对照组与空白对照组灌胃等量生理盐水，均连续给药25天。

2.5 观察指标（1）一般体征观察：术后每天观察各组大鼠的一般情况，每周测量大鼠体质量并记录。（2）术后存活率记录：观察并记录各组大鼠28天内存活情况。（3）瘤重与瘤重占脑重百分比测定：给药期间大鼠有死亡征兆或已经死亡时，取血，并立即取出全脑，称重；剥离瘤组织，再称重；28天后，麻醉处死所有大鼠，同样进行上述操作，测定各组大鼠的瘤重与瘤重占脑重百分比。（4）血清炎性因子表达检测：采用酶联免疫吸附法（Elisa）检测各组大鼠血清中IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ含量，操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明进行。（5）肿瘤组织病理检测：每组取部分大鼠的全脑组织，置于10%中性甲醛中，石蜡包埋后切成3～5μm的切片，经HE染色在光学显微镜下观察各组大鼠脑组织病理变化情况。（6）肿瘤组织CR-EB表达检测：采用Western Blot法检测，每组取部分大鼠的肿瘤组织，空白对照组取部分脑组织，提取总蛋白，进行蛋白定量，电泳，转膜，封闭，进行免疫反应，扫膜，曝光。

表1 四组胶质瘤大鼠体质量比较（g，）

表1 四组胶质瘤大鼠体质量比较（g，）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05

组别空白对照组模型组顺铂组清脑和血方组鼠数10 10 10 10 0天236.1±6.1 238.5±5.2 239.9±8.2 235.5±9.5 7天260.25±9.7 270.1±7.2 266.2±5.1 269.9±9.2 14天284.4±9.7 268.8±30.1* 282.7±10.4 288.8±11.3 21天293.7±14.7 258.1±38.7* 241.4±14.9** 272.9±21.9 28天301.4±16.2 246.3±27.2** / 280.0±27.6△

3 实验结果

3.1 清脑和血方对胶质瘤大鼠一般体征的影响空白对照组大鼠精神状况良好，毛发有光泽，行动自如、反应灵敏、抓惹激怒程度尚可，无明显竖毛，拱背，蜷缩现象，两便正常；其余各组大鼠反应逐渐变得迟钝、倦怠，活动减少，抓惹激怒程度明显不及空白对照组，毛发杂乱泛黄无光泽，且竖毛，拱背，蜷缩现象较为明显，尿量少，大便稀，术后精神萎靡。术后7天开始，各组大鼠生存状态逐渐变差，并逐渐出现不同程度的偏瘫或瘫痪，严重程度模型组>顺铂组>清脑和血方组。

术前各组大鼠体质量无显著差异；术后14天，模型组大鼠体质量显著轻于空白对照组（P＜0.05），并持续到28天。术后21天，与模型组比较，顺铂组大鼠体质量无显著差异（P>0.05）；与空白对照组比较，顺铂组大鼠体质量显著降低（P＜0.01），状态极差被处死。术后28天，与模型组比较，清脑和血方组大鼠体质量显著升高（P＜0.05），且与空白对照组比较，体质量无显著差异（P>0.05）。见表1。

3.2 清脑和血方对胶质瘤大鼠术后存活率的影响术后28天内，空白对照组大鼠生长良好，无死亡情况；模型组大鼠死亡7只，清脑和血方组死亡5只；顺铂组术后21天内已死亡7只，第21天余下3只状态极差，当即处死。

3.3 清脑和血方对胶质瘤大鼠瘤重和瘤重占脑重百分比的影响与模型组比较，顺铂组大鼠瘤重、瘤重占脑重百分比无显著差异（P>0.05），清脑和血组大鼠瘤重、瘤重占脑重百分比均显著降低（P＜0.01）。见表2。

表2 清脑和血方对胶质瘤大鼠瘤重、瘤重占脑重百分比比较（）

表2 清脑和血方对胶质瘤大鼠瘤重、瘤重占脑重百分比比较（）

注：与模型组比较，△P＜0.01

组别空白对照组模型组顺铂组清脑和血方组鼠数10 10 10 10瘤重（g）0 0.0779±0.0390 0.0525±0.0370 0.0121±0.0050△瘤重占脑重百分比（%）0 3.07±0.0176 2.80±0.0202 0.49±0.0075△

3.4 清脑和血方对胶质瘤大鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量的影响与空白对照组比较，其余各组大鼠血清IL-2、IL-10含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），IFN-γ和TNF-α含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，清脑和血方组和顺铂组的IL-2、IL-10含量均显著降低（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α含量均显著升高（P＜0.01）；且清脑和血方组的效果优于顺铂组（P＜0.05）。见表3。

3.5 清脑和血方对胶质瘤大鼠脑组织病理的影响

模型组瘤体积最大，浸润至皮层最为明显；清脑和血方组瘤体积变小，且颜色变浅，界线模糊，可见清脑和血方对抑制胶质瘤生长有一定作用。顺铂组胶质瘤浸润至皮层仍然较为明显。见图1（插页）。

表3 四组胶质瘤大鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量比较（pg/mL）

表3 四组胶质瘤大鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α含量比较（pg/mL）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与顺铂组比较，#P<0.05

组别空白对照组模型组顺铂组清脑和血方组鼠数10 8 7 8 IL-2 70.94±10.45 160.42±15.98** 114.92±9.72△91.14±10.33△#IL-10 30.89±5.88 92.17±7.71** 62.28±4.23△49.58±6.79△#IFN-γ 218.96±20.07 111.53±17.50** 173.76±10.62△198.54±11.83△#TNF-α 281.16±40.22 119.00±20.21** 195.82±12.87△209.41±21.82△#

3.6 清脑和血方对胶质瘤大鼠肿瘤组织环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding p-rotein，CREB）表达的影响Western Blot结果显示，空白对照组大鼠脑组织中CREB呈一定水平量表达，与空白对照组的（5.05±0.58）%比较，模型组为（11.40±1.37）%、顺铂组为（11.35±1.18）%、清脑和血方组为（10.75±0.52）%，肿瘤组织中CREB的表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，顺铂组肿瘤组织中CREB的表达水平无明显变化，清脑和血方组肿瘤组织中CREB的表达水平略有降低。见图2（插页）。

4 讨论

脑胶质瘤亦称神经胶质细胞瘤，由神经上皮组织衍化而来，具有发病率高、病死率高、治愈率低的特点。脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占脑内肿瘤的40%～50%[8]。2012年，中国肿瘤登记报告[5]指出中国脑及中枢神经系统恶性肿瘤死亡率为3.87/10万，位列十大高病死率肿瘤之第9位。手术切除是当前最主要的临床治疗手段。但是由于该肿瘤恶性程度高，其生长常以单个瘤细胞的侵袭和局部浸润为主，因此使得瘤组织和周边正常脑组织界线模糊，手术中难以区分从而不能完全切除，术后易复发[9]。化疗是脑胶质瘤治疗的重要手段之一，可以明显提高患者的生存状态，并延长生命周期[10]。由于肿瘤周边血脑屏障以及血瘤屏障的存在，常规水溶性化疗药物疗效受到限制，并且随着化疗药物剂量的增大，常出现严重的中枢神经系统甚至全身毒副作用。

中医以整体观念，辨证论治，调动患者自身的调节机制，以达治愈疾病的目的[11]。清脑和血方是本课题组成员在临床经典方的应用实践中总结精炼而成的经验方，由桃核承气汤合四物汤加天麻、蛇六谷、生山楂、蝉衣而成。桃核承气汤出自张仲景《伤寒论》，原治下焦蓄血证，脑瘤用之，是取上病则取其下之意。补血名方四物汤养血和血，可逐血痹，善治营血亏虚、血行不畅等证。桃核承气汤与四物汤二方合用，可下脑络之瘀毒，且攻邪不伤正，更有攻补兼施之妙。加上天麻、蛇六谷、生山楂、蝉衣，诸药合用，以养血和血、平肝通络、逐瘀抗癌。本实验采用Wistar大鼠建立脑胶质瘤模型，对大鼠进行给药干预后，观察大鼠情况，从而探讨清脑和血方对脑胶质瘤的抑制作用。

实验结果表明，造模后，与空白对照组大鼠比较，模型组大鼠体征状态最差，体质量持续减轻、死亡率高；瘤量和瘤重占脑重百分比最大，体积最大，肿瘤浸润皮层最严重；血清IL-2、IL-10含量显著升高，IFN-γ和TNF-α含量显著降低（P<0.01）；肿瘤组织中CREB表达水平显著升高。顺铂组大鼠体征状态较差，死亡率最高（P<0.01），瘤重和瘤重占脑重百分比无明显变化，肿瘤浸润皮层仍较严重；肿瘤组织中CREB的表达水平无明显变化，血清IL-2、IL-10含量显著降低，IFN-γ和TNF-α含量显著升高。而给予清脑和血方干预后，大鼠体征状态改善，体质量略有增加，生命周期略有延长，瘤重与瘤重占脑重百分比均显著降低，肿瘤浸润皮层明显减轻，与模型组比较，血清IL-2、IL-10含量显著降低，IFN-γ和TNF-α含量显著升高，肿瘤组织中CREB的表达水平略有降低。

近年研究[12-13]显示，环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）与胶质瘤的发生发展密切相关。CREB可以与CRE基因特异性结合，结合后CRE的下游基因转录活性会大大提高，并且它可以通过cAMP信号通路、Ca2+-Ca-MK、RAS/ERK、PI3K/AKt等多种磷酸化信号通路实现调节转录的功能。CREB的这种活性在肿瘤细胞的发生和发展中具有重要的作用。郑克彬等[14]临床试验显示，CREB在不同分化程度的脑胶质瘤组织中均存在过表达现象，与肿瘤的分化程度呈正相关，肿瘤恶性程度越高，CREB的相对表达量也就越高，提示CREB参与肿瘤的进展。本实验结果与该研究相吻合，模型组大鼠肿瘤组织中CREB明显高表达，而给予清脑和血方干预后，CREB的表达水平略有降低。

因顺铂不易透过血脑屏障，故顺铂并未对胶质瘤显示出较好的药效作用，如若使用临床一线的胶质瘤化疗药物替莫唑胺，实验结果将更具说服力，故阳性药物的选择是本实验的不足之处。

综上所述，清脑和血方能够明显抑制大鼠C6胶质瘤细胞的颅内生长，改善大鼠体征状态，其作用机制可能与调节机体免疫因子水平、抑制肿瘤相关蛋白CREB的表达有关。

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（收稿：2016-12-03修回：2017-01-16）

Therapeutic Effects of QingnaoHexue Formula on Treatment of Glioma in Rats and Its Preliminary Mechanism

XU Yanfang1,BIAN Yinyan2,WANG Tianyou2,YU Wenhua3,DONG Xiaoqiao3.
1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Internal Medicine, Lin'an Hospital of TCM,Lin'an(311300),China;3 Department of Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital, Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effects of QingnaoHexueformula（QNHXf）on rat glioma and to discuss the preliminary mechanism.MethodsC6 glioma cells was injected into Wistar rat brain with stereotaxic technique to build rat glioma model,then the model rats were randomly divided into 3 groups:model group,cisplatin group,and QNHXf group,with 10 rats in each group;another 10 healthy Wistar rats served as control group.The drugs were continuously dosing for 25days,then the rats were sacrificed to obtain brain tissue and the tumor and the blood samples. The brain tissue and tumor tissue were weighted for calculation of the ratio of tumor weight to brain weight and were observed for pathological changes with HE staining and the expression of CREB in tumor tissue with Western blot;the blood samples were used to detect the levels of IL-2,IL-10,TNF-α,and IFN-γ.ResultsThe tumor weight（0.0121± 0.0050g）,the ration of tumor weight to brain weight（0.49%±0.0075%）,the serumlevel of IL-2（91.14±10.33pg/mL）, IL-10（49.58±6.79pg/mL）in QNHXf groupwere significantlylower than those in model group（0.0779±0.0390g,3.70% ±0.0176%,160.42±15.98pg/mL,92.17±7.71pg/mL,all P<0.05）,while the serum level ofIFN-γ（198.54±11.83pg/mL）and TNF-α（209.41±21.82pg/mL）were significantly higher（111.53±17.50pg/mL,119.00±20.21pg/mL;all P<0.01）.ConclusionQNHXf can inhibit the growth of C6 glioma cells in the brain of rats.Its mechanism may be related to regulating immunologic factorsand inhibiting the expression of tumor associated protein CREB.

rats;glioma;QingnaoHexueformula;C6 cell;CERB

浙江省中医药科技计划项目（No.2013ZB098）；浙江省自然科学基金（No.Y17H270003）

1浙江中医药大学第一临床医学院（杭州310053）；2浙江省临安市中医院内科（临安311300）；3杭州市第一人民医院神经外科（杭州310006）

董晓巧，Tel：13588172841；E-mail：dxqhyy@163.com