RP—HPLC法同时测定人血清中奥氮平和富马酸喹硫平浓度

刘威+曹敏娟+尚翔+姚树永�í�

【摘要】目的：建立同时测定人血清中奥氮平、富马酸喹硫平浓度的高效液相色谱法。方法：血清样品以乙醚进行提取并测定，Hypersil C18反相柱 （150mm×46mm， 5μm）为色谱柱，流动相为25mmol/L磷酸盐缓冲液（pH60，内含05%三乙胺）-乙腈（65∶35，V/V），流速为10mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm。结果：奥氮平在100～2500μg、富马酸喹硫平在500～10000μg范围内峰面积与浓度呈良好线性关系；奥氮平、富马酸喹硫平的低、中、高3种浓度相对平均回收率分别为1033%、1008%、987% 和975%、982%、1011%，日内、日间RSD均低于10% （n=5）。奥氮平和富马酸喹硫平的检测限均为50μg/L。结论：该方法灵敏、准确，可用于临床奥氮平和富马酸喹硫平的血药浓度监测。

【关键词】高效液相色谱法；奥氮平；喹硫平；血药浓度

【中图分类号】R9141【文獻标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）11-0036-03

RP-HPLC Method for the Determination of Human Plasma of Olanzapine and Quetiapine Concentration

LIU WeiCAO MinjuanSHANG XiangYAO Shuyong

Suzhou Psychiatric Hospital， Suzhou 215000，China

Objective To establish a method for determination olanzapine and quetiapine in human serum by RP-HPLC.Methods The analytes were extracted after serum samples had been alkalinized. The HPLC separation of the analytes was performed on a reversed-phase Hypersil C18 column，using 25mmol·L-1 phosphat buffer （pH60，containing 05% triethylamine）-acetonitrile （65∶35， V/V） as mobile phase， with a flow-rate of 10mL·min-1 anda detective wavelength of 254nm.The temperature of the column was 40℃.Results The calibration curves were linear in the ranges of 100～2500μg·L-1 for olanzapine， 500～10000μg·L-1 for quetiapine respectively. The relation of peak area and concentration showed linear in the range of the average recoveries of olanzapine and quetiapine at high，middle and low concentrations were 1033%、1008%、987% and 975%、982%、1011% respectively. The intra-day and inter-day variations RSD were less than 10% （n=5）. The minimum detectable concentration of both olanzapine and quetiapine were 50μg·L-1.Conclusion The method is accurate， sensitive and simple for routine therapeutic drug monitoring （TDM） and for the study of the pharmacokinetics of olanzapine and quetiapine.

RP-HPLC ； Olanzapine ； Quetiapine ； Serum Drug Concentration

奥氮平（Olanzapine）和富马酸喹硫平（Quetiapine Fumarate）均为新型非典型抗精神病药[1]。奥氮平属于5-羟色胺（5-Hydroxy Tryptamine，5-HT）和多巴胺（Dopamine，DA）受体拮抗剂，能改善脑内多种神经通路功能，对于改善精神分裂症的阳性和阴性症状均有明显效果[2]。富马酸喹硫平的化学结构与奥氮平相似，属二苯二氮类衍生物，为脑内多种神经递质受体拮抗剂，主要作用于中枢多巴胺D1、D2和5-HT1、5-HT2等受体[3]。临床上，奥氮平和富马酸喹硫平常联合用于治疗复杂的精神分裂症[4-5]。由于精神药物血药浓度具有个体差异性大、安全范围窄等特点，因此进行血药浓度监测是十分必要的。近年来，检测奥氮平与喹硫平血药浓度的方法主要有高效液相电化学法（HPLC-ECD）、高效液相-质谱法（HPLC-MS）等[6-8]。但尚未见采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定奥氮平和喹硫平血药浓度的文献报道。因此，实验建立一种同时测定奥氮平和喹硫平血药浓度的高效液相色谱法，该方法灵敏、准确，为临床用药提供依据，节约分析时间。

1仪器与试剂

11仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（包括G1314F紫外检测器、G1316A柱温箱、G1329B自动进样器、G1311C多元泵、G1322A真空脱气机、Agilent Chem32化学工作站）；KS-120D型超声波清洗机（新芝仪器厂）；XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；电子分析天平（美国OHAUS）。

12材料奥氮平（批号：100948-201501）、富马酸喹硫平（批号：100815-201202）、阿米替林（批号100518-201303）对照品均源于中国食品药品检定研究院。奥氮平（批号：160204，江苏豪森药业股份有限公司）；喹硫平（批号：B151133，湖南洞庭药业股份有限公司）。

空白血清由苏州市广济医院血站提供。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

21色谱条件色谱柱：Hypersil ODS柱（150mm×46mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（pH60，内含05%三乙胺）-乙腈（65∶35.V/V），使用045μm微孔滤膜负压过滤；流速：10mL/min；检测波长：254nm，柱温：40 ℃；进样量：20μL。

22对照品和内标溶液配制精密称取奥氮平对照品与喹硫平对照品各1mg，分别置于10mL量瓶，加甲醇溶解并定容，得到质量浓度为 01mg/mL的对照品溶液置冰箱4℃保存。临用时用甲醇稀释成所需浓度的奥氮平与喹硫平对照品溶液。精密配制浓度为 2mg/L阿米替林甲醇溶液作为工作内标液。

23样品处理方法取含奥氮平和喹硫平的血清样品1mL，加内标10μL（2mg/L阿米替林），并加入25%维生素C溶液10μL及10mol/L氢氧化钠溶液02mL，快速震荡数秒。加入乙醚4mL提取，在旋涡混合器上涡旋2min，静置1h，取出醚层，置尖底试管中，于30℃水浴至干。残渣用100μL流动相复溶，取20μL进样分析。

24色谱分离情况在本实验条件下，空白血清、奥氮平与喹硫平对照品血清，以及精神病患者服药后的血清样品，经高效液相色谱分析法测定，得到的色谱图见图1。由图1可知，奥氮平、喹硫平和阿米替林内标物的色谱峰能够完全分离。奥氮平、阿米替林和喹硫平的保留时间为47min、58min、83min。

25标准曲线的制备在7个具塞的离心管中分别加入空白血清10mL，再分别加入不同浓度、相同体积的奥氮平和喹硫平对照品溶液和内标物阿米替林，振荡数秒，使血清奥氮平浓度分别为10、20、40、80、100、125、250μg/L，喹硫平为50、100、200、400、500、800、1000μg/L。然后按照“23”项处理后，经高效液相色谱分析，测得奥氮平和喹硫平峰面积 （Ai）， 内标物峰面积As， 以Ai/As比值为横坐标，以血清样品所对应其各点浓度为纵坐标绘制标准曲线，经最小二乘法线性回归，得到奥氮平10～250μg，喹硫平50～1000μg范围的血清浓度标准曲线。奥氮平的标准曲线回归方程为C=03117Ai/As-32145 （r=09972），喹硫平的标准曲线回归方程为C=02066Ai/As+21861 （r=09995）。当信噪比（S/N）=3时，奥氮平与喹硫平的检测定量下限可达到5μg/L。

26回收率与精密度实验取奥氮平质量浓度为10、80、250μg/L的含药血清样品，喹硫平质量浓度为50、400、800μg/L的血清样品，经色谱分析，得到的相对回收率均大于90%。同时在1d内重复5次和2周内重复5次测定浓度，计算日内、日间误差和回收率。结果表明，该方法符合生物样品分析要求。见表1。

27[JP+1]稳定性试验按“23”项下方法配制奥氮平质量浓度为10、80、250μg/L，喹硫平质量浓度为 50、400、800μg/L的血清样品共18份（1式3份），分别考察室温放置4h、4℃冰箱放置24h、-20℃冰箱冻存1周后的稳定性，分别进行色谱分析。结果未见冻存样品的药物降解，RSD均<15%。[JP]

28样品的质量控制实验按照“23”项的方法分别配置奥氮平（10、80、250μg/L）和喹硫平（50、400、800μg/L）血清样品共36个血清样品（1式6份），置于-20℃冻存备用为质控样品。每次检测血样时同时检测质控样品，如果相对回收率均落在85%～115%之内即可认为检测正常，否则须检查整个操作过程及仪器原因。

29患者血样测定1例男性精神病患者，口服奥氮平15mg/d和喹硫平400mg/d。2周后早晨服药前空腹采血检测其血清药物浓度。结果奥氮平为613μg/L，喹硫平为3102μg/L。

3讨论

奥氮平和喹硫平结构中都有苯环，紫外吸收明显。奥氮平与喹硫平对照品溶液在190～400nm的波长范围内进行紫外扫描，发现喹硫平和奥氮平在254nm处均有强吸收峰，因此本实验选择254nm作为最佳检测波长。

本实验考察了不同柱温（25～40℃）、不同流速 （08～15 mL/min）、不同pH磷酸盐缓冲液（40、60、686）的流动相系统，结果表明柱温为40℃、流速为10mL/min、流动相为磷酸盐缓冲溶液（pH60）-乙腈（65∶35）时，柱效较高，主药峰与杂质峰能够有效地分离。实验过程中分别使用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷为提取剂，发现乙醚的提取率最高，所取血清1mL，进样量20μL可达到实验要求，提高了灵敏度，避免样品杂质的干扰，可达到分析目的。奥氮平在储存和提取中易被空气氧化，因此加入维生素C作为抗氧剂。

奥氮平和喹硫平血药浓度具有治疗窗窄、个体差异大等特点，因此进行血药浓度监测是必要的[9]。单独检测奥氮平和喹硫平药物血药浓度已有报道[6-8]，但还未见使用高效液相色谱法同时测定这两种药物的报道。实验建立了人血清中奥氮平和喹硫平同时测定的方法，准确、灵敏并能满足临床需要，可以用于临床药物监测。

参考文献

[1]GOBBI G， COMAI S， DEBONNEL G.Effects of quetiapine and olanzapine in patients with psychosis and violent behavior： a pilot randomized， open-label， comparative study[J].Neuropsychiatr Dis Treat， 2014 （10）：757-765.

[2]袁道瑞，张向荣，陆蓉，等. 精神分裂症患者血脂水平对奥氮平血浆药物浓度的影响[J].四川精神卫生，2015（4）：310-313.

[3]PLOSKER GL.Quetiapine： a pharmacoeconomic review of its use in bipolar disorder[J].Pharmacoeconomics， 2012 ， 30（7）：611-631.

[4]张静，闽国庆. 奥氮平联合富马酸喹硫平治疗精神分裂癥的临床观察[J]. 中国药房，2016 （9）： 1173-1176.

[5]付永强.奥氮平联合富马酸喹硫平治疗精神分裂症的疗效观察[J].医学理论与实践，2017， 30（2）.

[6]ZHENG Q， WANG F， LI H， et al.Quantitative analysis of olanzapine in rat brain microdialysates by HPLC-MS/MS coupled with column-switching technique[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2012（905）：127-132.

[7]李文标，王传跃，翟屹民，等.国产与进口奥氮平片的人体药动学及生物等效性[J]. 中国新药杂志，2005，14（5）： 599-602.

[8]李坤艳，李焕德. HPLC-MS/ESI～+测定人血浆中喹硫平及其代谢产物[J]. 中南药学，2006， 4 （2）： 88-91.

[9]HIEMKE C， BAUMANN P， BERGEMANN N， et al. AGNP Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Psychiatry： Update 2011[J]. Pharmacopsychiatry， 2011， 44（6）： 195.

（收稿日期：2017-04-01编辑：梁志庆）