短短芽孢杆菌的鉴定及其抑菌物质的初步研究

龚国利， 王忠忠

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安市微生物药物工程实验室， 陕西 西安 710021)



短短芽孢杆菌的鉴定及其抑菌物质的初步研究

龚国利1，2， 王忠忠1

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安市微生物药物工程实验室， 陕西 西安 710021)

从美国黄石国家公园土样分离到一株耐高温菌株S1039，经过形态、生理生化以及16SrDNA测序分析鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis).并对其产生的抑菌物质粗提物的部分性质进行了初步探究.实验结果表明，菌株S1039产生的抑菌物质粗提物具有良好的抑菌活性，并且耐高温、耐碱性物质、对胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感.能够抑制革兰氏阴性菌及阳性菌的生长，具有工业开发前景.

鉴定； 短短芽孢杆菌S1039； 抑菌物质

0 引言

益生芽孢杆菌是芽孢杆菌属中一类好氧或兼性厌氧，产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，在自然界广泛分布于植物根际土壤，空气及水体中.该类菌形成的芽孢能够产生对热、电磁辐射、紫外线很强的抗性，因此环境适应性优良，其中绝大多数的益生芽孢杆菌分泌的次级代谢产物具有抑制植物病原真菌及病原细菌的作用.例如，枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素: 伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)等对人体肠道中的致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌有较强的抑制作用[1].地衣芽孢杆菌(Bacilluslichnifarimis)产生的杆菌肽能够有效控制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、甲烷杆菌(Methanebacillus)等G+和G-细菌[2,3].多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)产生的碱性多肽类抗生素多粘菌素E对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)等革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用[4].短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)是一种能够分泌短杆菌肽(gramieidin)、短杆菌酪肽(tyrocidine)、胞外多糖[5]、几丁质酶[6]以及羟苯乙酯[7]等多种抑菌物质的微生物[8,9]，因此在生物防治上具有广阔的应用前景.

本研究从美国黄石国家公园淤泥中分离筛选出一株高效产抗菌物质的芽孢杆菌S1039，经过形态，生理生化特征及16SrDNA序列分析等方法鉴定为短短芽孢杆菌，并对其产生的抗菌物质粗提物的部分理化性质进行了初步探究.

1 材料与方法

1.1 主要原料与仪器

1.1.1 主要原料

(1)菌株分离土样

采集自美国黄石国家公园.

(2)培养基

NA：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，pH7.2;发酵培养基：豆饼粉1.5%，蛋白胨2.0%，氯化钙0.20%，Twen-20 1%，pH7.2.

(3)试剂

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶、DNA marker、 PCR扩增试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯，天津市天力化学试剂有限公司.

1.1.2 主要仪器

PCR仪(PCR-9700)，西安天隆科技有限公司；核酸电泳仪(4001P)，北京六一仪器公司；电泳槽(BIO-RAD)、BIS910凝胶成像系统，北京东胜创新生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株分离

准确称取1 g待分离土样，加入到10 mL的无菌试管中，再加入9 mL的双蒸水充分混匀，做系列梯度稀释(10-1～10-8)，取稀释度为10-5、10-6、10-7、10-8的土壤悬液于80 ℃水浴保温处理10 min，冷却至室温，涂布平板(NA)，37 ℃恒温培养48 h，挑取单菌落至指示菌培养基(金黄色葡萄球菌及大肠杆菌)验证抑菌圈的产生，将产抑菌圈的单菌落转接至新的NA中做纯化培养.

1.2.2 菌株的形态及生理生化特征测定

将菌株S1039接种于NA平板上，于37 ℃培养16 h，在光学显微镜下观察菌体的形态特征，培养48 h观察菌落的颜色及外部特征.生理生化特征型鉴定参照文献[10]及伯杰氏细菌鉴定学手册[11].

1.2.3 菌体基因组DNA的提取、16SrDNA扩增、测序及序列比对分析

(1)基因组DNA提取

将活化培养16 h的菌体接一环于NB培养基中，37 ℃、220 rpm恒温振荡培养20 h，用细菌基因组快速提取试剂盒(上海捷瑞)提取菌体基因组DNA，4 ℃保存备用.

(2)16SrDNA扩增

PCR扩增50μL的反应体系：25μL 2×PCRmaster mix，基因组DNA(37.5μg/mL) 0.5μL，细菌16SrDNA扩增通用引物27F： (5′-AGTTT GATCMTGGCTCAG-3′)1μL(10μM)，1492R：(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)1μL(10μM)，剩余体积用dd H2O补足至50μL.

PCR反应循环条件： ①96 ℃预变性4 min；②94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环(变性-退火-延伸)；③72 ℃修复延伸10 min，使16SrDNA扩增完整.取5μL的PCR产物进行琼脂糖(1%)凝胶电泳观察扩增效果，并将PCR产物纯化(PCR产物纯化试剂盒)送至上海生工生物工程有限公司完成测序.

(3)16SrDNA序列比对分析

通过在线输入测序结果至Genbank(http://www.ncbinl m.nih.gov/Blast/)进行序列同源性比较，采用RDP (http:rdp.cme.msu.edu/)，MAGA6.06软件构建系统发育树，确定菌株S1039的分类位置.

1.3 抗菌粗提物制备及其抑菌活性测定

1.3.1 抗菌粗提物的制备

将新分离的菌株S1039以4%(V/V)接种量接种于50 mL(300 mL摇瓶)的发酵培养基中，28 ℃、180 rpm摇瓶培养36 h，4 ℃下12 000 rpm 离心20 min，得上清，向无菌上清液加入固体硫酸铵粉末至终浓度70%，4 ℃过夜，8 000 rpm 离心15 min，取5 mL的25 mmol/L(pH7.0)的磷酸盐缓冲液溶解沉淀得抗菌物质的粗提物，4 ℃保存备用.

1.3.2 抑菌活性测定

采用双层平板琼脂扩散法进行菌株S1039抗菌粗提物抑菌活性测定.平板底层加入15 mL素琼脂水溶液，上层加入25mL NA(混有金黄色葡萄球菌CVCC1885或大肠杆菌BL21(108CFU/mL)，制成指示细菌培养基.无菌牛津杯(7 mm)打孔，加入200μL 的抗菌粗提物，测定其抑菌活性，抑菌活性的大小用抑菌圈直径来表示，以25 mmol/L(pH7.0)的磷酸盐缓冲液做对照，每组试验重复三次.

1.4 抗菌粗提物部分性质初步探究

1.4.1 蛋白酶对抗菌粗提物抑菌活性的影响

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、链酶蛋白酶，分别配成5 mg·mL-1的酶液，取200μL的抗菌粗提物与上述各蛋白酶液等量混合，4 ℃静置2 h，分别取上述蛋白酶处理液200μL至指示菌培养基中， 37 ℃恒温培养48 h，琼脂扩散法测定各蛋白酶处理液的抑菌活性，以未处理的抗菌粗提物及25 mmol/L的磷酸盐缓冲液做对照，每组试验重复三次.

1.4.2 不同pH 对抗菌粗提物抑菌活性的影响

取8个50 mL的三角瓶，每个三角瓶中加入5 mL的抗菌粗提物，用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L的NaOH分别调pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室温条件下静置4 h，再依次将各粗提液pH调至7.0，分别取不同pH值处理的抗菌粗提物200μL至指示菌培养基中， 37 ℃恒温培养48 h，测定不同酸碱度处理的粗提液抑菌活性，以未处理的抗菌粗提物及25 mmol/L的磷酸盐缓冲液做对照，每组试验重复三次.

1.4.3 抑菌物质稳定性

取6支2 mL的离心管，每支离心管中加入1.5 mL的抗菌粗提物，分别置于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴中保温处理10 min，待冷却至室温，分别取不同温度处理的抗菌粗提物200μL至指示菌培养基中， 37 ℃恒温培养48 h，测定不同温度处理的抗菌粗提物的抑菌活性变化，以未处理的抗菌粗提物及25 mmol/L的磷酸盐缓冲液做对照，每组试验重复三次.

1.4.4 抑菌阴阳性检验

将大肠杆菌BL21(108CFU/mL)，金黄色葡萄球菌CVCC1885(108CFU/mL)等采用牛津杯琼脂打孔法分别制成指示菌平板，向孔中加入150μL的发酵离心上清液(S)及发酵原液(C)，37 ℃恒温培养48 h，测定菌株S1039发酵上清液是否能够抑制阴阳性细菌的生长，以发酵原液及水洗沉淀做对照，每组试验重复三次.

2 结果与讨论

2.1 菌株S1039鉴定结果

2.1.1 S1039的菌落及菌体形态特征

菌株S1039的菌落及菌体形态特征如图1所示.由图1可以看出， S1039细胞短杆状、芽孢中生、呈椭圆形、革兰氏染色阳性，菌落边缘较整齐、灰白色、表面光滑湿润、不产生可溶性色素.

(a)菌落形态

(b)革兰氏染色1 000倍油镜观察图1 菌株S1039菌落及菌体形态特征

2.1.2 16SrDNA测序分析

16SrDNA PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示.由图2可以看出，菌株S1039 16SrDNA扩增片段在1.5 kb左右，符合细菌16SrDNA片断大小，在凝胶成像仪紫外条件下快速切割该目的条带，薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收后(上海捷瑞)，送至上海生工生物工程有限公司测16SrDNA序列大小为1 478 bp，

序列信息为CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGTCTCTTCGGAGGCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGATGGCTTCGGCTATCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTG CAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAA CACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTG TAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT TGGGGGTTTCAATACCCTCAGTGCCGCAG CTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAG TACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGA CCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTTCGGGG CAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTA GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGA GAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGG CGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT GGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGA GAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTC AGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTA CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACA.

图2 S1039的16SrDNA扩增电泳图

NCBI在线登录使用Blastn在GeneBank基因库中进行同源性搜索，通过从Genebank中选择与此菌株16SrRNA相似性最高的其它菌株的16S rRNA序列，采用MAGA 6.06构建菌株系统发育树如图3所示.由图3可以看出，S1039与短短芽孢杆菌Brevibacillusbrevisstrsin CanS-411 (KT5 80607.1)的亲缘关系最近，且在一个分支中.由此证明，菌株S1039为短短芽孢杆菌.

图3 S1039的16SrDNA序列系统进化发育树

2.1.3 菌株S1039生理生化试验结果

短短芽孢杆菌S1039的生理生化特征性试验结果如表1所示.

表1 短短芽孢杆菌S1039的生理生化特征

注：+表示阳性反应；-表示阴性反应；V表示阳性或阴性反应.

2.2 菌株S1039胞外抗菌粗提物的抑菌活性测定结果

采用双层平板琼脂扩散法测定抗菌粗提物的抑菌活性，其结果如图4所示.由图4可以看出，以金黄色葡萄球菌CVCC1885(108CFU/mL)做指示菌，抗菌粗提物的抑菌直径为18.6 mm，以大肠杆菌BL21(108CFU/mL)做指示菌，抗菌粗提物的抑菌直径为21.4 mm.说明菌株S1039产生的抑菌物质具有良好的抑菌活性[12].

(a)金黄色葡萄球菌CVCC1885

(b)大肠杆菌BL21图4 S1039胞外抗菌粗提物抑菌活性测定

2.3 菌株S1039胞外抗菌粗提物的部分性质

2.3.1 蛋白酶对抗菌粗提物抑菌活性的影响

不同蛋白酶液处理后的抗菌粗提物抑菌活性测试结果如图5所示.由图5可以看出，胰蛋白酶、胃蛋白酶处理过的抗菌粗提物抑菌活性无明显下降，蛋白酶k及链霉蛋白酶处理过的抗菌粗提物抑菌活性明显下降，说明该抑菌物质对其敏感.

图5 不同蛋白酶对抗菌粗提物抑菌活性影响

2.3.2 pH对抗菌粗提物抑菌活性的影响

不同pH对胞外抗菌粗提物抑菌活性影响如图6所示.由图6可以看出，当pH在7～8时，抗菌物质的抑菌活性最好，抑菌圈直径为18.76 mm，pH低于7时，抑菌活性明显下降.当pH降为3时，仍有一定的抑菌活性.pH高于8时，抗菌物质抑菌活性随着pH的增大而缓慢减小，表明该抑菌物质对碱类物质不敏感或其本身就是一类碱性物质[13].

图6 不同pH值对胞外抗菌粗提物抑菌活性的影响

2.3.3 温度对抗菌粗提物抑菌活性的影响

不同温度对抗菌粗提物的抑菌活性影响如图7所示.由图7可以看出，在研究的温度变量范围内，40 ℃恒温水浴处理的抗菌物质抑菌活性最高.随着温度的持续升高，抗菌物质的抑菌活性呈缓慢下降的趋势，在50 ℃～70 ℃之间抑菌活性基本不变，温度高于70 ℃时，抑菌活性下降较明显，当温度达到100 ℃时，抗菌物质抑菌活性下降了31%，说明该抗菌物质具有良好的热稳定性[12,14,15].

图7 不同温度对抗菌粗提物抑菌活性的影响

2.3.4 抗菌物质抑革兰氏阳性及阴性菌检验

短短芽孢杆菌S1039产生的抑菌物质对革兰氏阴性菌及阳性菌抑菌性检验如图8所示.由图8可以看出，菌株S1039均能够抑制大肠杆菌BL21(阴性菌)及金黄色葡萄球菌CVCC1885(阳性菌)的生长，并且从抑菌圈的大小能够说明该抑菌物质对阴性菌的抗性较强于阳性菌，其是否能够抑制真菌及病原菌的生长还有待进一步试验验证.

(a)金黄色葡萄球菌CVCC1885

(b)大肠杆菌BL21图8 抗菌物质抑制革兰氏阳性及阴性菌检验

另外取出离心沉淀，超声破碎10 min，无菌水洗涤3次，以无菌水洗破碎的沉淀溶液作对照，结果发现，水洗沉淀无抑菌圈产生，表明该抑菌物质分泌于胞外，而对照组有较小的抑菌圈产生，出现这种情况的原因可能是：(1)未水洗沉淀中大量细胞含有少量的胞外分泌物；(2)发酵上清液未彻底去除.

3 结论

菌株S1039分离于美国黄石国家公园土壤，经形态、生理生化特征测定[11]，16SrDNA测序在线比对分析(http://www.ncbi.Nlm.nih.gov/ Blast/)，鉴定S1039为短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)，采用MAGA6.06构建菌株系统发育树，确定了菌株S1039的进化分类位置.

短短芽孢杆菌S1039分泌的胞外抗菌物质对胃蛋白酶，胰蛋白酶不敏感，对蛋白酶K较敏感.在100 ℃沸水浴中持续煮沸10 min，室温冷却验证仍有69%的抑菌活性，表明该抗菌物质具有良好的热稳定性.在pH7～8之间，该抗菌物质抑菌活性最好，抑菌直径达18.76 mm.此外，该抗菌物质能够抑制革兰氏阴性菌及阳性菌的生长，但其是否对真菌及其它病原菌具有抗性还有待进一步验证.下一步将对菌株S1039分泌的抗菌物质有效活性成分进行提取纯化，鉴定该抗菌物质的化学结构.

[1] 陈天游,董思国,袁佩娜,等.1株枯草芽胞杆菌体外拮抗6种肠道致病菌的研究[J].中国微生态学杂志,2005,17(1):10-12.

[2] Radyowski M,Bartkowiak S,Winiarczyk K,et al.Differential influence of bacitracin on plant proteolytic enzyme activities[J].Biochim Biophys Acta,2005,1722(1):1-5.

[3] Ming L J,Epperson J D.Metal binding and structure-activity relationship of the metalloantibiotic peptide bacitracin[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2002,91(1):46-58.

[4] 邢维玲,周希贵,王贺祥,等.多粘菌素E高产菌株的选育[J].中国抗生素杂志,2002,27(6):326-327.

[5] 郝晓娟,刘 波,谢关林,等.短短芽孢杆菌JK-2菌株抑菌物质特性的研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2007,33(5):484-489.

[6] Li S,Zhao Z A,Li M,et al.Purification and characterization of a novel chitinase from Bacillus brevis[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(4):557-563.

[7] Jianmei C,Bo L,Zheng C,et al.Identification of ethylparaben as the antimicrobial substance produced byBrevibacillusbrevisFJAT-08 09-GLX[J].Microbiological Research,2015,172:48-56.

[8] 车建美.短短芽胞杆菌(Brevibacillusbrevis)对龙眼保鲜机理的研究[D].福建：福建农林大学,2011.

[9] 薛东红.短短芽孢杆菌XDH的鉴定及其抗菌物质的分离、纯化与部分性质研究[D].泰安：山东农业大学,2006.

[10] 江 滟,王 和.微生物学实验教程(案例版)[M].北京：科学出版社,2011.

[11] R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京： 科学出版社,1984.

[12] Guo Y,Yu Z,Xie J,et al.Identification of a new Bacillus licheniformis,strain producing a bacteriocin-like substance[J].Journal of Microbiology,2012,50(3):452-458.

[13] 申吉泓.抗菌肽作用机制研究现状[J].国际肿瘤学杂志,2003,30(5):347-350.

[14] Motta A S,Lorenzini D M,Brandelli A.Purification and partial characterization of an antimicrobial peptide produced by a novel Bacillus sp.isolated from the Amazon Basin[J].Current Microbiology,2007,54(4):282-286.

[15] 剧建格.高效广谱抗菌肽产生菌的筛选及发酵条件的研究[D].保定：河北农业大学,2009.

【责任编辑：蒋亚儒】

Identification ofBrevibacillusbrevisstrain and preliminary study on its antibacterial substance

GONG Guo-li1,2, WANG Zhong-zhong1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021 ,China； 2.Xi′an Microbiology and Pharmaceutical Engineering Laboratory, Xi′an 710021, China)

A high temperature resistant strain S1039 was isolated from the soil samples of the Yellowstone National Park,which was identified asBrevibacillusbrevisby morphological,physiological and biochemical and 16SrDNA sequencing.And the partial properties of the crude extract of the antimicrobial substance produced by strain S1039 were initially tested.The results showed that the bacteriostatic substance has good thermal stability and is not sensitive to pepsin,trypsin and alkaline substances.Which could inhibit the growth of Gram-negative bacteria and positive bacteria and have the prospect of industrial development.

identification;BrevibacillusbrevisS1039; antibacterial substances

2017-02-07

陕西省教育厅自然科学专项科研计划项目(14JK1101)； 西安市未央区科技计划项目(201309)

龚国利(1976-)，男，内蒙古丰镇人,教授，博士，研究方向:微生物发酵

2096-398X(2017)04-0126-06

Q939.92

A