细胞癌细胞系的建立与生物学特性的关联研究

袁方，王国利，王艳，吴涛，徐佳

沈阳医学院

细胞癌细胞系的建立与生物学特性的关联研究

袁方，王国利，王艳，吴涛，徐佳

沈阳医学院

目的以原代培养的喉鳞状细胞癌组织细胞为例，观测细胞癌细胞系的生物学特性。方法通过组织块培养法，体外原代培养喉鳞状细胞癌组织细胞，细胞传代超过25次时，观察细胞的样态、细胞角蛋白的组织化学染色、检验细胞增值周期、培养法检验支原体、聚合酶链反应法（PCR法）鉴别细胞种类、STR-短串联重复序列基因分型。结果新建立一株喉鳞状细胞癌细胞系，定名为TR-LCC-1，其大多数形态为多边形细胞，铺路石样变异、叠层生长，除了形态区别于其他细胞外，其体积也比较大。细胞角蛋白的组织化学染色呈阳性。繁衍30代之后，细胞群体倍增时间提高到201.2小时。对细胞间期进行检验，发现DNA合成前期（G1期）占51.71%，DNA合成期（S期）占44.56%，DNA合成后期（G2期）占2.28%。培养法检验支原体，未发现污染。聚合酶链反应法（PCR法）鉴别TR-LCC-1种类属于人来源细胞。对STR-短串联重复序列进行检验，发现P26与P6一致，异于已知细胞的短串联重复序列。结论人来源喉鳞状细胞癌的细胞系TRLCC-1，可以作为样本以研究喉鳞状细胞癌的特性。

喉肿瘤细胞；鳞状细胞；原代培养；细胞系；生物学特性

近些年，我国癌症发病率普遍提高，对于喉癌等这类常见头颈疾病来说，国内主要采用手术与化疗结合治疗的方式，但效果不明显，生存5年以上的比例几乎未见变化。特别是中晚期喉癌患者，放疗之后往往还需要切除病变器官，以致于患者呼吸困难、无法正常发音，对其心理、生理造成双重影响。所以，提高治疗技术，对喉肿瘤细胞系进行生物学研究，寻找新的医学手段，迫在眉睫。对喉肿瘤细胞进行体外培养，建立喉肿瘤细胞系，是分析病变细胞的生物学特性、形态特性等的前提条件，但是，当前我国的形势是：能够试验用的喉鳞状细胞癌组织细胞十分有限，而原来的Hep-2细胞株大多数已经被同实验室的HeLa细胞系污染，失去了研究价值。所以，医学界只能利用组织块培养法原代培养喉鳞状细胞癌细胞，把建立的新细胞系取名为TR-LCC-1，并应用于喉癌细胞的试验研究，分析生物学特性，鉴别其种类。

1 试验方法

1.1 试验材料

喉鳞状细胞癌组织细胞，对未坏死部分进行组织块培养。

1.2 方法

1.2.1 癌细胞组织建系过程

（1）在无菌的操作模式下，在未坏死喉癌细胞组织上取2X2cm的材料标本，选取部位要求其颜色为鱼白色、质地要统一、柔软且有光泽。

（2）用无菌生理盐水清洗标本两次之后，快速侵入到组织细胞培养基础液中（青霉素含量200U/ml,链霉素含量200mg/L,二性霉素B含量2mg/L），在4℃条件下，浸泡2h～3h。

（3）无菌生理盐水（含青霉素、链霉素及二性霉素B）及RP⁃MI-1640培养基（10%牛血清）分别冲洗三次。

（4）取2个半径为2～4mm的癌细胞组织块，分别放置在培养瓶底部进行组织培养。培养条件：培养液含10%血清；培养箱温度为37℃，CO2为5%，湿度饱和。需要注意：2小时之后，要旋转培养瓶，以便使喉癌组织小块在培养液中能够完全浸泡。

（5）一周之后，若贴壁的的喉癌组织小块中的细胞融合比例达到60%，则进入细胞消化传代培养阶段，频率为每周1到2次。另外，可用反复贴壁方法分离、清除成纤维细胞。

1.2.2 免疫细胞化学染色

（1）用盖玻片接种细胞，并使其呈单层排列

（2）采用PBS-磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）冲洗细胞，浸入甲醇-丙酮固定液中，使细胞保持原有状态、结构。

（3）苏木精-伊红染色（HE染色）、细胞角蛋白免疫组化染色。

1.2.3 MTT（四甲基偶氮唑蓝比色法）检测细胞增殖情况

（1）用胰酶降解、消化对数生长期阶段的细胞，配制细胞悬液。

（2）充分混匀细胞悬液之后，利用血球计数板进行细胞显微计数，分别在每个孔中滴入100ul，采用24孔板，共5张，有序摆放在培养箱（37℃，co2:：5%）内，持续检验5天。

（3）隔天，在距结束细胞培养4h的时间段，在每个中孔滴入50mg四甲基偶氮唑蓝溶液。

（4）经过4h之后，用吸管清除培养基液，并在每个孔中滴入100ul的二甲基亚砜（DMSO）。

（5）置于振荡器上5～10min，用波长为570nm的酶标仪进行吸光度检测。

1.2.4 PI-FACS（碘化丙啶染色法）检测细胞增殖周期

当细胞增殖，使其覆盖率达到80%时，进行胰酶蛋白消化处理；离心细胞5min，1200r/min；用磷酸缓冲盐溶液（4℃、PH值在7.2～7.4之间）冲洗细胞组织；在乙醇含量为70%的溶液中固定1h以上；离心细胞5min，1500r/min；在1.0～1.5ml细胞染色液中进行细胞重悬，预计细胞的上机通过率能在200～350cell/s时，上机检验。

1.2.5 支原体检测

利用分离培养法检验支原体是否被感染，在保障细胞上机通过率为200～350cell/s时，置于琼脂平板上，显微检测是否有特征性病变。

1.2.6 STR--短串联重复序列检测

提取并分离DNA，检验其荧光信号，对比分析STR。

2 结果

2.1 形态观察

利用倒置相差显微镜观察细胞系TR-LCC-1，发现其大多呈多边形状态，似铺石路样叠层增殖。经苏木精—伊红染色法发现，其异型性明显，细胞核和细胞质比重加大，核仁数量突增，不对称性、三极性及多极性核分裂等现象增加。

2.2 免疫细胞化学染色

经免疫组织化学细胞角蛋白染色结果分析，发现鳞状上皮细胞AE1/AE3值高，由此证明，细胞系TR-LCC-1归属于上皮细胞。

2.3 体外培养情况

TR-LCC-1细胞系在进入对数生长阶段初始，增殖速度迅速，于第三天达到顶峰。细胞倍增时间达到201.2小时。

2.4 细胞周期分析

周期结果检验测定：G1期为51.7%，S期为44.56%，M期为1.45。

2.5 特性检测结果

支原体（培养法）显示为阴性。PCR法（聚合酶链反应法）检验结果显示细胞系TR-LCC-1属于人来源细胞。其中P26和P6的STR一致，均区别于已知细胞。

3 结论

喉癌属于较为多见的一种恶性疾病，具可靠数据显示，其发病率和死亡率都相对较高[2]。在我国，目前的主要治疗方式还是采用手术与化疗相结合，但是其效果不够理想，喉癌患者的死亡率仍居高不下[3]，所以加大喉癌细胞的生物学特性的研究力度，建立细胞系，进行体外原代培养，为相关医学研究奠定了坚实基础，具有十分重要的现实意义。

[1]罗瑞华，齐金星，翟翼飞.中国居民喉癌死亡水平分析[J].中国卫生产业，2012,（31）:160.