C1型尼曼-匹克病小鼠生长繁殖及血液生理生化指标的测定分析

乔梁，杨恩慧，杨记超，顾巧美，董宏天，林俊堂*，闫欣*

(1. 新乡医学院生命科学技术学院， 河南 新乡 453003； 2. 河南省医用组织再生重点实验室， 河南 新乡 453003)

研究报告

C1型尼曼-匹克病小鼠生长繁殖及血液生理生化指标的测定分析

乔梁1,2，杨恩慧1,2，杨记超1,2，顾巧美1，董宏天1，林俊堂1,2*，闫欣1,2*

(1. 新乡医学院生命科学技术学院， 河南 新乡 453003； 2. 河南省医用组织再生重点实验室， 河南 新乡 453003)

目的 测定SPF级C1型尼曼-匹克病小鼠(Npc1-/-小鼠)的生长繁殖及血液生理生化指标，为开展NPC1病人的研究提供理论性的基础资料。方法 ①选取0～77日龄Npc1-/-、Npc1+/-和Npc1+/+小鼠雌雄各40只，定期称重并绘制生长曲线；②Npc1-/-小鼠由Npc1+/-小鼠交配繁殖产生，统计Npc1+/-小鼠连续4代的繁殖数据；③检测60日龄Npc1-/-和Npc1+/+小鼠的血液生理生化指标。结果 ①Npc1-/-小鼠的体重在7周前随着日龄的增加而增加，7周后随着日龄的增加而减少，直至11周左右死亡。Npc1+/+和Npc1+/-小鼠的体重均随着日龄的增长而逐渐增加，两者之间并没有显著差别。4周后雄性比雌性体重增加明显比雌性小鼠快； ②Npc1+/-小鼠不同代内交配分娩间隔、窝产仔数、离乳仔数、离乳仔数中雌雄数量及阳性数量差异无显著性(P>0.05)，而第2代的离乳率明显大于第1代(P<0.05)； ③Npc1-/-和Npc1+/+小鼠血液生理指标中平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均过氧化物酶指数(MPXI)差异有显著性(P<0.05)，其余差异无显著性(P>0.05)。生化指标中尿素(UREA)差异有极显著性(P<0.01)，而天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、葡萄糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、钾(K)和铜(Cu)等差异有显著性(P<0.05)，其余差异无显著性(P>0.05)。结论 ①Npc1-/-、Npc1+/-和Npc1+/+小鼠的生长曲线因基因型和性别的不同而存在差异； ②Npc1+/-小鼠不同代的繁殖能力差异无显著性； ③Npc1-/-和Npc1+/+小鼠的部分血液生理生化指标差异有显著性。

C1型尼曼-匹克病,小鼠；生长曲线；繁殖；血液参数

C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type C1，NPC1)是由Npc1基因(18q11，OMIM #257220)突变引起细胞内脂类代谢异常的一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病。NPC1在各个年龄段均可发病，多在发病后的5～20年内死亡[1,2]。临床上初期表现为肝脾肿大，后期逐渐出现进行性神经系统受损，如共济失调、垂直性核上性眼肌麻痹、肌张力障碍、构音障碍、吞咽困难、痴呆和癫痫等，因其临床表型多种多样，易被误诊和漏诊。目前，针对NPC1尚无有效的治疗手段。

C1型尼曼-匹克病小鼠(BALB/cNctr-Npc1m1N/J，Npc1-/-小鼠)是Npc1基因自然突变的小鼠，其病理改变和临床表现与人NPC1非常相似。因此，Npc1-/-小鼠是研究NPC1的理想动物模型[3]。目前，NPC1患者临床样本获得极为困难，利用Npc1-/-小鼠开展NPC1研究显得尤为重要。Morris等[4]曾对Npc1-/-小鼠的部分生长繁殖及血液生化指标进行分析，其结果并不能全面反映Npc1-/-小鼠的生理状况。而国内关于SPF级Npc1-/-小鼠生长繁殖及血液生理生化指标的研究几乎没有报道，其背景资料还不是很充实。因此，本实验利用从浙江大学医学院引进的SPF级Npc1+/-小鼠，繁育扩大后对其后代进行详细的生长、繁殖性状及血液生理生化指标等测定，进而为利用Npc1-/-小鼠开展人NPC1的研究提供重要的基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Npc1+/-小鼠由浙江大学医学院段树民院士研究组提供。原种群自美国Jackson实验室(002760)引进，屏障环境动物房内进行饲养和繁殖。6～8周Npc1+/-小鼠按雌雄2∶1配对合笼，交配后获得突变型(Npc1-/-)、杂合型(Npc1+/-)和野生型(Npc1+/+)小鼠。

1.1.2 饲养管理及环境

实验小鼠在IVC独立送风隔离笼具中饲养繁殖，温度20～26℃，相对湿度30%～65%，压差10～20 Pa，换气次数20 次/时，进风速度30～35 m/s，目标压差13 Pa，空气洁净度<100级，噪声<55 dB，自动控制；12 h光照/12 h黑暗，自由摄食与饮水，定期更换垫料。

小鼠用垫料由广州赛博诺生物科技有限公司提供【SCXK(京)2014-0008】。小鼠繁育饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供【SCXK(京)2014-0010】。饲料的营养成分为：水分85.5 g/kg、粗蛋白224 g/kg、粗脂肪46.6 g/kg、粗纤维37 g/kg、粗灰分66 g/kg，钙11.4 g/kg，总磷8.2 g/kg。饮用水为纯水/超纯水一体化系统(默克密理博)制备的纯水。鼠笼、水瓶、水、饲料和垫料等物品均经MAST脉动真空灭菌器(新华医疗)灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间20 min，置换时间4 min，干燥时间10 min，脉动次数3。

1.1.3 实验仪器

电子天平(精确到0.1 g，深圳信诺普电子衡器厂)；XS-500i血液分析系统(希森美康)；ADVIA 2400全自动临床生化分析仪(西门子)；5415R 冷冻离心机(Eppendorf)；常规手术器械。

1.2 实验方法

1.2.1 基因型鉴定

剪3～5 mm鼠尾放入PCR管中，加入50 μL碱性溶液(25 mmol/L NaOH，0.2 mmol/L EDTA)，95℃裂解30 min，室温冷却后加入50 μL中和液(40 mmol/L Tris-HCl， pH 5)混匀，取2 μL进行PCR反应。

采用两对引物对小鼠基因型进行鉴定(表1)。PCR反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，63℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 2 min。最后，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因型。

表1 基因型鉴定引物Tab.1 Primers used for genotype identification

1.2.2 生长曲线测定

用电子天平分别称取120只0～77 日龄小鼠(Npc1-/-、Npc1+/-和Npc1+/+小鼠各40只，♂♀各半)的体重，每周称重一次，绘制生长曲线。

1.2.3 繁殖数据统计

收集和统计Npc1+/-小鼠的F1、F2、F3、F4代的交配分娩间隔、窝产仔数、离乳仔数、离乳率、离乳仔数中雌雄数量及阳性数量。

1.2.4 血液生理指标测定

将60日龄的Npc1-/-和Npc1+/+小鼠摘眼球取血，送新乡雅仕杰医学检验所用XS-500i血液分析系统检测29项血常规指标(表3)。

1.2.5 血液生化指标测定

将剩余的全血4℃静止1 h后，3000 r/min离心15 min，分离出血清，送新乡雅仕杰医学检验所用ADVIA 2400全自动临床生化分析仪检测27项血生化指标(表4)。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 基因型鉴定

取同窝出生的21日龄小鼠进行基因型鉴定，结果如图1所示，Npc1-/-小鼠：1条带，475 bp；Npc1+/+小鼠：1条带，173 bp；Npc1+/-小鼠：2条带，分别为173 bp和475 bp。

2.2Npc1-/-小鼠的生长曲线

雌、雄Npc1-/-小鼠的体重在7周前随着日龄的增加而增加，7周后随着日龄的增加而减少。4～5周体重快速增长，6～7周体重增加缓慢，7周之后体重逐步减少，直至11周左右死亡。5周前雌雄小鼠体重基本无差异，6～7周雄性小鼠体重增加明显比雌性小鼠快，7周后雌性小鼠体重减少明显比雄性小鼠快。

雌、雄Npc1+/+和Npc1+/-小鼠的体重均随着日龄的增加而增加，4周时出现一个快速生长期，之后体重增加缓慢，最后趋于稳定。4周前雌雄小鼠体重基本无差异，随后雄性小鼠体重增加明显比雌性小鼠快。雄性Npc1+/+和Npc1+/-小鼠的体重4周后基本无差异，而雌性Npc1+/-小鼠体重比Npc1+/+略低。

图2 Npc1-/-、Npc1+/-和Npc1+/+小鼠的生长曲线Fig.2 Growth curves of the Npc1-/-, Npc1+/-, and Npc1+/+ mice

2.3Npc1+/-小鼠繁殖性能

由于Npc1-/-小鼠不育，需要通过Npc1+/-小鼠交配进行繁殖。因此，对17窝SPF级Npc1+/-小鼠产仔进行连续4代统计(表2)，离乳小鼠分别为131、112、136和109只，共计448只。随后分别统计4代内交配分娩间隔、窝产仔数、离乳仔数、离乳率、离乳仔数中雌雄数量及阳性数量(表2)。分析表明不同代内交配分娩间隔、窝产仔数、离乳仔数、离乳仔数中雌雄数量及阳性数量差异无显著性(P>0.05)，而第2代的离乳率明显大于第1代(P<0.05)。

表2 Npc1+/-小鼠繁殖性状Tab.2 Reproductive performance of the Npc1+/- mice

注：与第1代相比，*P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the F1 mice.

表3 Npc1-/-小鼠血液生理指标Tab.3 Blood physiological parameters in the Npc1-/- mice

注：与Npc1+/+相比，*P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with theNpc1+/+mice.

2.4Npc1-/-小鼠血液生理指标测定

与Npc1+/+小鼠相比，Npc1-/-小鼠的红细胞血红蛋白含量(MCH)明显降低，而过氧化物酶指数(MPXI)则显著性上升，差异达到显著水平(P<0.05)，其余生理指标差异无显著性(P>0.05)。

2.5Npc1-/-小鼠血液生化指标测定

Npc1-/-和Npc1+/+小鼠血液生化指标测定结果如表4所示，其中Npc1-/-小鼠的尿素(UREA)与Npc1+/+小鼠差异达到极显著水平(P<0.01)。天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、葡萄糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、钾(K)和铜(Cu)与Npc1+/+小鼠差异达到显著水平(P<0.05)，其余生化指标差异无显著性(P>0.05)。

表4 SPF级Npc1-/-小鼠血液生化指标Tab.4 Blood biochemical parameters in the SPF Npc1-/- mice

注：与Npc1+/+相比，*P<0.05。与Npc1+/+相比，**P<0.01。

Note.*P<0.05, compared with theNpc1+/+mice;**P<0.01, compared with theNpc1+/+mice.

3 讨论

Npc1-/-小鼠的Npc1基因发生自然突变，导致所表达的NPC1突变蛋白丧失脂质转运功能，从而使胆固醇、葡萄糖酰鞘氨醇、鞘糖脂GM2和GM3等脂类分子在细胞中沉积[5]。而胞体内大量脂质沉积，会阻碍不同神经细胞的生长发育和它们之间的脂质循环，影响神经元胞膜、髓鞘和胶质细胞的正常结构和功能，最终导致神经细胞变性坏死[1]。Npc1-/-小鼠的神经病理学改变主要为神经元变性、轴突球状体形成和髓鞘形成障碍等，类似于人NPC1的神经病变组织，故作为NPC1动物模型已广泛用于NPC1的研究中。

Npc1-/-小鼠体重在整个生长发育过程中比Npc1+/+和Npc1+/-小鼠明显要低，尤其是在7周以后体重明显减少。Npc1-/-小鼠在4～6周时出现运动障碍和认知功能受损，9周时出现进行性共济失调，10～12周左右死亡[4,6，7]。因此，Npc1-/-小鼠在6～7周时表现发育迟缓。而7周后神经退行性症状不断加剧，导致Npc1-/-小鼠后肢慢慢瘫痪，进食逐步减少，体重明显减轻，直至11周左右死亡(平均死亡率为67.5%)。

Npc1-/-小鼠通过Npc1+/-小鼠交配繁殖而来，不同代次之间的繁殖性能无明显差异。Npc1基因突变影响胆固醇的运输，从而干扰性激素的产生，阻碍精巢和卵巢的发育过程，导致Npc1-/-小鼠不育[8，9]。Npc1+/-小鼠第2代离乳率与第1代之间存在显著的差异(P<0.05)，可能的原因是雌鼠生产第1代时，哺乳仔鼠的经验不足，随着年龄的增长其哺乳能力逐渐增强，后3代的离乳仔数和离乳率相对第1代都要高。另外，Npc1-/-小鼠阳性数量不受代次和性别的影响，说明Npc1+/-小鼠4代内的繁殖性能较好。

Npc1-/-和Npc1+/+小鼠的血液生理指标(MCH和MPXI)和生化指标(UREA、AST、GLU、LDH、K和Cu)存在显著差异。Npc1-/-小鼠的肝脏病变严重，常见肝脾肿大。肾脏的肾间质出现纤维化，肾脏衰老导致肾功能衰退[4]。因此，与肝和肾功能相关的生化指标(UREA、AST、LDH和K)出现明显的升高。但是，与NPC1脂类代谢异常的指标(TC、LDL-C、HDL-C和TC)并没有差异，而NPC1临床分析表明TC和HDL-C存在差异[10]，揭示常规的血液检查在诊断NPC1方面存在不准确性。

本实验通过对SPF级Npc1-/-小鼠的生长发育、繁殖性能和血液生理生化指标的测定及分析，可为使用Npc1-/-小鼠研究NPC1提供基础数据。同时，建立Npc1-/-小鼠生长繁殖及血液生理生化等指标的数据库，为进一步研究NPC1的发病机制和药物开发提供了参考依据。不过，其生物学特性还需进一步完善。

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Analysis of growth, reproductive and blood physiological and biochemical parameters in Niemann-Pick disease type C1 mice

QIAO Liang1,2, YANG En-hui1,2, YANG Ji-chao1,2, GU Qiao-mei1, DONG Hong-tian1, LIN Jun-tang1,2*, YAN Xin1,2*

(1. College of Life Science And Technology, Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China； 2. Henan Key Laboratory of Medical Tissue Regeneration,Xinxiang 453003)

Objective To investigate the growth curve, breeding rate, and blood physiological and biochemical parameters inNpc1 gene mutant mice (Npc1-/-) for providing theoretical evidence in research on Niemann-Pick disease type C1 (NPC1) patient. Methods 1) The body mass ofNpc1-/-,Npc1+/-, andNpc1+/+mice (n=120; 60♀, 60♂) was measured from 0 to 77 days; (2) AsNpc1-/-mice were born only by the matingNpc1+/-mice, the breeding rate ofNpc1+/-mice was counted here from the 1st to 4th generation; (3) The blood physiological and biochemical parameters were measured on bothNpc1-/-andNpc1+/+mice at 60 days. Results 1) Compared with the wild type controls，the body weight ofNpc1-/-mice was progressively increased up to 7 weeks and then decreased, and died around 11 weeks. The body weight of theNpc1+/-andNpc1+/+mice was increased as time went on. After 4 weeks, the male mice showed a higher weight gain than the females; (2) The generations ofNpc1+/-mice had no significant difference in mating-parturition interval, litter size, weaning litter and the number of male and female (P>0.05), but the weaning rate of the 2nd generation was significantly higher than that of the 1st generation (P<0.05); (3) The hematological parameters showed a significant difference only in mean corpuscular hemoglobin (MCH) and mean peroxidase index (MPXI) between theNpc1-/-andNpc1+/+mice (P<0.05). No significant difference was found in other hematological parameters (P>0.05). Among the biochemical parameters, aspartate aminotransferase (AST), glucose (GLU), lactate dehydrogenase (LDH), potassium (K) and copper (Cu) had a significant difference between theNpc1-/-andNpc1+/+mice (P<0.05). Conclusions 1) The growth curves ofNpc1-/-,Npc1+/-, andNpc1+/+mice are different due to different genotype and sex; (2) The reproduction rates ofNpc1+/-mice have no significant difference among different generations; (3) The blood physiological parameters (MCH, MPXI) and biochemical parameters (UREA, AST, GLU, LDH, K, Cu) are significantly different betweenNpc1-/-andNpc1+/+mice.

Niemann-Pick disease type C1, Mice; Growth rate; Reproduction; Hematological parameters

LIN Jun-tang. E-mail: linjtlin@126.com. YAN Xin. E-mail: Email： pangyufu@aliyun.com

国家自然科学基金项目(编号：81400936，81600987，U1304808)；河南省高等学校重点科研项目(编号：16A180014)；河南省高校科技创新人才支持计划(14HASTIT032)；河南省科技发展计划项目(142300410192)；新乡医学院精神神经医学学科群支持计划。

乔梁(1985-)，男，博士，专业：发育神经生物学。Email： qiaoliang927@163.com

林俊堂(1976-)，男，教授，研究方向：神经发育与干细胞诱导分化。Email: linjtlin@126.com；闫欣(1980-)，男，教授，研究方向：神经退行性疾病与细胞发育。Email： pangyufu@aliyun.com。*共同通讯

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0250-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.004

2016-11-11