卵白蛋白介导白毛黑眼兔变应性鼻炎模型树突状细胞功能的改变

屠珏，徐孝平，谷焕鹏，陈方明，刘军平，徐剑钦*

(1. 浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所，杭州 310053； 2. 浙江中医药大学基础医学院，杭州 310053)

研究报告

卵白蛋白介导白毛黑眼兔变应性鼻炎模型树突状细胞功能的改变

屠珏1，徐孝平1，谷焕鹏2，陈方明1，刘军平1，徐剑钦1*

(1. 浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所，杭州 310053； 2. 浙江中医药大学基础医学院，杭州 310053)

目的 比较观察卵白蛋白(OVA)诱导的白毛黑眼兔(WHBE兔)和日本大耳白兔(JW兔)变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)模型外周血来源树突状细胞(dendritic cells, DC)的功能，揭示WHBE兔对AR敏感的可能机制。方法 以OVA诱导建立WHBE兔和JW兔AR模型，每次激发后观察动物一般体征，进行鼻黏膜HE染色，观察组织病理学改变。分离外周血DC，流式细胞仪检测外周血DC表面分子CD86的表达以及DC摄取抗原的能力，同时，采用荧光定量PCR检测外周血DC甘露糖受体(mannose receptor, MR)的mRNA表达水平。进一步以CFSE标记T细胞，流式细胞仪检测外周血DC诱导T细胞增殖能力。结果 一般体征和HE染色观察显示，WHBE兔和JW兔模型组动物均表现为典型的变应性鼻炎症状和组织病理学改变，提示模型构建成功。WHBE兔AR模型组外周血DC CD86的表达不仅极显著高于正常对照组，亦极显著高于JW兔AR模型组(P<0.01，P<0.01)。正常稳态下，WHBE兔外周血DC MR的mRNA相对表达量极显著高于JW兔(P<0.01)，经OVA诱发建立AR模型，WHBE兔外周血DC MR的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，且显著高于JW兔模型组(P<0.05)。并且，WHBE兔模型组外周血DC摄取OVA647的能力极显著高于正常对照组(P<0.01)，亦极显著高于JW兔模型组(P<0.01)。结论 WHBE兔DC对变应原更敏感，可能与其高表达抗原识别受体MR，具备更强的分化成熟、摄取抗原能力有关。

卵白蛋白；变应性鼻炎；WHBE兔；树突状细胞

变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)，是指特应性个体接触变应原后主要由免疫球蛋白E(IgE)介导的介质(主要是组织胺)释放，并有多种免疫活性细胞和细胞因子参与的鼻黏膜I型变态反应疾病。随着全球污染程度的加大，变应性鼻炎患病率逐年上升，尤其是最近的30年，发病率迅速增加，成为目前最主要的过敏性疾病之一，影响着全球20%的人群健康[1]。实验性AR模型尤其是对致病因素敏感的天然实验动物模型的研究、开发和应用，对研究变应性鼻炎的发病机制、筛选治疗药物和治疗手段具有非常重要的意义。

白毛黑眼兔(WHBE兔)是我中心自日本大耳白兔生产群中发现并培育而建立的一个新实验兔种群。前期培育和应用研究已显示，WHBE兔对免疫反应敏感，属过敏体质[2，3]。近期研究发现，WHBE兔对卵白蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的AR模型比其突变背景品系日本大耳白兔(JW兔)更敏感，很可能是变应性鼻炎易感的天然动物模型[4]，而WHBE兔对变应性鼻炎易感的机制有待阐明。大量研究表明，广泛分布于皮肤和黏膜系统的树突状细胞(dendritic cells, DC)在变应原诱发的免疫反应过程中扮演着重要角色[5]，DC识别变应原后分化成熟，诱导CD4+T细胞向Th2细胞分化，是变应性鼻炎发病的必要条件[6，7]。本实验用卵白蛋白作变应原，致敏诱发变应性鼻炎模型，比较观察变应性鼻炎WHBE兔和JW兔外周血DC功能，探讨WHBE兔外周血DC的功能特点，阐述WHBE兔对AR易感的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级WHBE兔、JW兔各12只，2.0～2.5 kg，雄性，购于新昌县大市聚镇欣健兔场【SCXK(浙)2015-0004】，各品系均随机分为正常对照组和变应性鼻炎组，每组6只。饲养及实验操作均在浙江中医药大学动物实验研究中心普通环境内【SYXK(浙)2013-0184】进行。单笼饲养，自由饮水和采食，昼夜明暗交替时间12 h/12 h，室温(20±1)℃，湿度(50±10)%。

1.2 主要仪器与试剂

Axiovert 200荧光倒置显微镜(ZEISS，德国)，Forma 3111型细胞培养箱(Thermo，美国)，1300生物安全柜(Thermo，美国)，Varioskan Flash多功能酶标仪(Bio-Rad，美国)，Fc500流式细胞仪(Beckman，美国)，NanoZoomer 2.0RS数字病理切片扫描仪(滨松，日本)，卵白蛋白(OVA, A5503)(Sigma，美国)，2%氢氧化铝凝胶(vac-alu-250)(InvivoGen，美国)，RPMI 1640(Gibco，美国)，青-链霉素(Gibco，美国)，胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)，兔外周血淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物医学工程研究所，中国)，CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒(南京碧云天生物技术有限公司，中国)，Alexa Fluor 647标记的OVA(OVA647)(Molecular Probes，美国)，重组人GM-CSF和IL-4(Peprotech，美国)，CD86(B7-2)-PE抗体(Beckman，美国)，尼龙毛(Polysciences，美国)，SYBRTMPremix EXTaqⅡ试剂盒(Takara，日本)，MiniBEST Universal RNA提取试剂盒(Takara，日本)。

1.3 方法

1.3.1 模型建立

[4]方法，1.5 mg OVA溶于0.5 mL生理盐水中，加入0.5 mL 2%氢氧化铝凝胶作为佐剂，1∶1体积充分混匀形成OVA致敏液，变应性鼻炎模型组腹腔注射，隔日一次，共8次，为基础致敏；于第l7天起用1% OVA溶液每侧滴鼻0.1 mL激发过敏症状，每日一次共5次，空白对照组用生理盐水代替。

1.3.2 一般体征观察

试验期间每日观察每组兔的采食、饮水、排便和精神活动状态，并密切观察各组兔激发后的过敏反应情况。

1.3.3 鼻黏膜组织病理学检查

最后一次激发30 min后，每只兔耳静脉注入5 mL空气处死，即刻取鼻中隔黏膜组织，放入10% 中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察组织病理学变化。

1.3.4 外周血树突状细胞分离培养

兔耳中动脉取血，肝素钠抗凝，以等体积Hank’s液稀释，轻轻添加到外周血淋巴细胞分离液上层，水平离心2000 r/min×20 min，收集中间云雾状单个核细胞，以PBS洗涤3次，去上清，以RPMI 1640完全培养液重悬细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养2 h，吸出未贴壁细胞。加入含20 ng/mL GM-CSF和20 ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养6 d。

1.3.5 流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的表达

培养第6天的DC以10 μg/mL OVA刺激过夜，以PBS洗涤，以PE标记的一抗室温避光孵育30 min，PBS洗涤，流式细胞仪检测CD86的表达。

1.3.6 荧光定量PCR检测DC甘露糖受体的表达

收集培养6 d 的外周血DC，参照试剂盒说明书，用离心柱法抽提细胞总RNA，反转录cDNA，-20℃储存备用。甘露糖受体(mannose receptor, MR)引物由生工生物设计合成(NCBI Reference Sequence: XM_002717356.3)。引物序列(5’-3’)：F-GCCCACCACAACTCCTGAAC；R-AGCCAACTCTCCACCCACA，长度154 bp。Real-time PCR检测目的基因mRNA的表达水平，以β-actin作内参，2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。

1.3.7 DC摄取抗原能力的检测

外周血DC调整浓度为每毫升5×105个，接种于24孔细胞培养板，每孔加入OVA647(终浓度20 μg/mL)，于37℃、5%CO2培养箱孵育1 h，流式细胞仪检测DC对OVA647的摄取百分比。

1.3.8 同种异体的混合淋巴细胞反应

培养第6天的DC以10 μg/mL OVA刺激过夜，以PBS洗涤，收集。分别取正常对照WHBE兔和JP兔外周血，以淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，经T细胞尼龙毛柱分离纯化后得到T细胞。按试剂盒方法，以CFSE 37℃染色10 min，以含10% FBS的培养基洗涤2遍。外周血DC与同种异体T 细胞以1∶5的比例于37℃，5%CO2培养箱共同培养5 d，流式细胞仪检测T细胞增殖。

1.3.9 统计学处理

2 结果

2.1 症状和体征观察

OVA激发后，模型组动物均出现了不同程度的躁动不安，鼻分泌物增加，鼻部发黄，抓痒次数增加，打喷嚏，下鼻甲肿胀，通气受阻等典型的变应性鼻炎症状和体征。正常组实验兔的一般体征均无明显异常表现。

2.2 组织病理学改变

鼻黏膜组织光学显微镜下观察，两个品系模型组动物鼻黏膜组织结构疏松，可见黏膜坏死脱落，黏膜下层可见大量嗜酸性粒细胞浸润，腺体增生，毛细血管充血。正常对照兔鼻黏膜结构完好，未见血管充血，黏膜下层未有嗜酸性粒细胞浸润。见图1。

2.3 外周血DC表面共刺激分子的表达

流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86的表达，结果见图2。CD86是DC的标记性抗原，它的表达水平代表着DC分化成熟的能力。结果显示，与正常对照组比较，经OVA诱发建立AR模型，两种品系兔外周血DC CD86的表达均有所升高。其中，WHBE兔AR模型组外周血DC CD86的表达不仅极显著高于正常对照组(P<0.01)，亦极显著高于JW兔AR模型组(P<0.01)。

2.4 外周血DC MR的mRNA表达水平

荧光定量PCR检测培养第7天的外周血DC MR的mRNA表达水平，结果见图3。在正常稳态下，WHBE兔外周血DC MR的mRNA相对表达量极显著高于JW兔(P<0.01)。经OVA诱发建立AR模型，WHBE兔外周血DC MR的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，且显著高于JW兔模型组(P<0.05)。

注：A-D分别为WHBE兔正常对照组、WHBE兔AR模型组、JW兔正常对照组、JW兔AR模型组。图1 兔鼻黏膜的组织病理学改变(HE染色，×400)Note. A: Normal control group of WHBE rabbits, B: AR model group of WHBE rabbits, C: normal control group of JW rabbits, D: AR model group of JW rabbits.Fig.1 Histopathological changes of the nasal mucosa of rabbits with AR

注：组间比较采用LSD-t检验。与正常组比较，**P<0.01;与JW兔AR模型组比较，##P<0.01。图2 流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86的表达Note.LSD-t test was used in the comparison between groups.Compared with the normal control group,**P<0.01;Compared with the AR model group of JW rabbits,##P<0.01.Fig.2 Expression of CD86 of DCs detected by flow cytometry

注：组间比较采用LSD-t检验。不同小写字母表示组间差异有显著性(P<0.05)。图3 外周血DC MR的mRNA表达水平Note.LSD-t test was used in the comparison between groups. Significances were designated as different lower-case letters (P<0.05).Fig.3 MR mRNA expression of the peripheral blood dendritic cells

2.5 外周血DC摄取抗原的能力

分别收集诱导培养7 d 的两个品系兔外周血DC，流式细胞仪检测DC的抗原摄取率，结果见图4。在正常稳态下，两个品系兔外周血DC摄取OVA647的能力差不多，抗原摄取能力较弱，经OVA诱导建立AR模型，外周血DC摄取OVA647的能力均有所升高。其中，WHBE兔AR模型组外周血DC摄取OVA647的能力极显著高于正常对照组(P<0.01)，亦极显著高于JW兔AR模型组(P<0.01)。

注：组间比较采用LSD-t检验。与正常组比较，**P<0.01;与JW兔AR模型组比较，##P<0.01。图4 外周血DC抗原摄取能力Note.LSD-t test was used in the comparison between groups.Compared with the normal control group,**P<0.01;Compared with the AR model group of JW rabbits,##P<0.01.Fig.4 Ability of allergen uptake of the peripheral blood dendritic cells

2.6 外周血DC诱导T细胞增殖的能力

以CFSE [5-(and 6-)-carboxyfluoresce indiacetate succinimidyl ester] 标记T细胞，流式细胞仪分别检测WHBE兔和JW兔外周血DC刺激同种异体T细胞增殖的能力，结果如表1。变应性鼻炎动物的T细胞经混合淋巴细胞反应(MLR)后，有丝分裂的细胞数均显著高于正常对照(NC)动物(P<0.05)，其中进行二次有丝分裂的细胞数极显著高于NC组(P<0.01)。

表1 外周血DC诱导T细胞增殖的能力(%细胞数，n=3)Tab.1 Proliferation ability of T cells induced by dendritic cells

注：与WHBE兔正常对照组比，*P<0.05，**P<0.01；与JW兔正常对照组比，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the WHBE NC group,*P<0.05,**P<0.01; Compared with the JW NC group,#P<0.05，##P<0.01.

3 讨论

树突状细胞是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cells, APC)，广泛分布于皮肤和黏膜系统。它是唯一能刺激初始型T淋巴细胞增殖的专职APC，在调节Th细胞分化、T淋巴细胞免疫耐受和免疫记忆方面起着关键的作用。已有研究表明，DC在兔的动脉粥样硬化斑块形成[8，9]、类风湿关节炎[10]、骨关节炎[11]等发病机制中均扮演着重要角色。临床研究和小鼠实验发现[6,12]，局部和体循环中的DC功能异常从而调控Th2细胞极化是变应性鼻炎的主要发病机制。研究DC在WHBE兔变应性鼻炎发生发展中的功能特点，有利于阐明WHBE兔对变应性鼻炎易感的机制。

卵白蛋白加氢氧化铝诱导变应性鼻炎是目前国际上最常用的AR造模方法。本文以OVA基础致敏16 d，滴鼻激发5 d，每次激发30 min内，动物均表现鼻分泌物增加，抓痒次数增加，打喷嚏等典型的变应性鼻炎症状。鼻黏膜HE染色组织观察显示，模型组动物鼻黏膜组织结构疏松，可见黏膜坏死脱落，黏膜下层可见大量嗜酸性粒细胞浸润，腺体增生，毛细血管充血，表现为典型的AR鼻黏膜组织病理学改变(图1)。以上结果提示变应性鼻炎模型构建成功。

研究表明[13]，DC经变应原刺激后，能通过高表达CD86等表面分子，为T细胞活化提供共刺激信号，诱导Th0细胞向Th2细胞分化。因此，CD86是调节Th2细胞极化的协同刺激分子，它的表达水平代表着DC分化成熟的能力。本文研究发现，在正常稳态下，两个品系兔外周血DC CD86的表达均处于较低水平，且未见差异。以OVA诱发建立AR模型，两个品系兔外周血DC CD86的表达均升高，其中，WHBE兔组间呈现极显著差异(P<0.01)。并且，WHBE兔AR模型组DC CD86的表达极显著高于JW兔(P<0.01)。说明WHBE兔DC经变应原激发后具有更强的分化成熟的能力，能为T细胞活化提供更强的第二信号。

DC对变应原的识别和摄取是诱发变应性鼻炎的关键步骤。甘露糖受体(mannose receptor, MR)是DC内吞环境中糖蛋白变应原的最初受体[14]，直接影响DC对变应原的敏感性和摄取抗原的能力，被认为是治疗变应性鼻炎的关键靶点之一[15]。本文研究发现，在正常稳态下，WHBE兔外周血DC MR的mRNA相对表达量极显著高于JW兔(P<0.01)。经OVA诱发建立AR模型，WHBE兔外周血DC MR的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，且显著高于JW兔模型组(P<0.05)。进一步观察其抗原摄取能力，结果显示，WHBE兔AR模型组外周血DC抗原摄取能力极显著高于JW兔(P<0.01)。提示，WHBE兔DC对变应原更敏感，可能与其高表达抗原识别受体MR，具备更强的抗原摄取能力有关。

经变应原诱导成熟的DC能通过高表达表面共刺激分子，为T细胞增殖、分化，启动免疫应答提供第二信号。本文混合淋巴细胞反应结果显示，AR模型组进行有丝分裂的T细胞数显著高于正常对照组(P<0.05)，但两个品系兔之间未呈现差异，说明变应性鼻炎WHBE兔外周血DC刺激T细胞增殖的能力与JW兔相当。那么，WHBE兔AR模型中，外周血DC是否具有更强的诱导Th2型细胞分化以及向Th2细胞进行抗原提呈的能力，有待于进一步实验研究和验证。

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Functional changes of dendritic cells in the WHBE rabbits with allergic rhinitis induced by ovalbumin

TU Jue1, XU Xiao-ping1, GU Huan-peng2, CHEN Fang-ming1, LIU Jun-ping1, XU Jian-qin1*

(1. Laboratory Animal Research Center； 2. School of Basic Medicine,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Objective To observe and compare the function of peripheral blood derived dendritic cells (DC) in white hair black eyes (WHBE) rabbits and Japanese white (JW) rabbits with allergic rhinitis (AR) induced by ovalbumin (OVA), and to explore the mechanism of sensitivity to allergen in WHBE rabbits. Methods For the AR induction, rabbits were sensitized intraperitoneally everyday with OVA emulsified in Al(OH)3followed from day 17 onward by 5 times nasal challenges with OVA in each nostril. General symptoms and histopathological changes of the nasal mucosa were observed. Expressions of CD86 on cell surface and antigen uptake of peripheral blood-derived dendritic cells were detected by flow cytometry at 6 days of culture. The mannose receptor (MR) mRNA expression was tested by real-time PCR. Proliferation of CFSE [5-(and 6-)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester]-labelled T cells stimulated by DC were observed by flow cytometry. Results The rabbits sensitized by OVA showed typical AR symptoms and pathological changes.Expressions of CD86 on the cell surface of dendritic cells in WHBE rabbits with AR were significantly upregulated not only compared with the normal control (NC) rabbits, but also with the JW rabbits with AR (P<0.01). The result of real-time PCR assay showed that MR mRNA expression of DC in the NC group of WHBE rabbits were significantly higher than that of the JWrabbits(P<0.01). Moreover, MR mRNA expression of DCs in the WHBE rabbits with AR were not only significantly higher than that in the NC rabbits (P<0.05), but also higher than that in the JW rabbits with AR (P<0.05).Meanwhile, OVA647internalization percentages of DCs in the WHBE rabbits with AR were not only significantly higher than that in the NC rabbits, but also obviously higher than that in the JW rabbits with AR (P<0.01). Conclusions The sensitivity of WHBE rabbits to allergen may largely depend on the function of dendritic cells with high expression of mannose receptor and their strong ability of maturation and antigen uptake.

Ovalbumin; Allergic rhinitis; WHBE rabbits; Dendritic cells

XU Jian-qin. E-mail: xujianqing1@zcmu.edu.cn

浙江省科技计划项目(批准号：2014C37007);浙江中医药大学比较医学创新团队(XTD201301)。

屠珏(1982-)，女，实验师，研究方向为实验动物与细胞生物学。E-mail: zheyu1114@126.com

徐剑钦(1980-)，男，实验师，研究方向为实验动物与比较医学。E-mail: xujianqing1@zcmu.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0295-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.011

2016-10-02