萝卜叶黄酮的超声波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

吴海清，甄润英,通信作者，何新益，孙贵宝

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300384；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384）

萝卜叶黄酮的超声波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

吴海清1,2，甄润英1,2,通信作者，何新益1,2，孙贵宝1,2

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300384；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384）

用超声波辅助乙醇提取萝卜叶中的黄酮。通过单因素试验与四元三次正交试验，对黄酮的超声波辅助醇提工艺进行优化，以体外清除（·OH）和（O2-·）的能力为指标，研究萝卜叶黄酮的抗氧化活性。最优条件：乙醇浓度为60%，料液比为1:15（m∶V），超声波处理15 min，在50 ℃下浸提30 min，该条件下黄酮提取率为1.41%，是传统浸提法的200%；萝卜叶黄酮对·OH和O2-·均有明显的清除作用，在试验剂量下，清除效果随着黄酮浓度的增加而增强，对·OH和 O2-·的半数抑制率（IC50）分别为0.643 8、1.523 1 mg/mL。结果表明：超声波辅助提取是一种高效的提取萝卜叶黄酮方法，其抗氧化活性较高。

萝卜叶；黄酮；超声波；辅助；抗氧化

萝卜叶为十字花科植物萝卜的根出叶，又名萝卜杆、莱菔叶和莱菔菜等。现代营养学研究表明，萝卜叶的营养价值在很多方面均高于萝卜，如Vc含量是萝卜的2倍以上，钙、镁、铁、锌以及核黄素、叶酸等含量是萝卜的3～10倍[1]。近年来，国内的一些学者相继开展了萝卜叶的综合利用研究。吴海清等[2]将萝卜叶制成酱菜，并比较测定了不同加工阶段萝卜叶酱菜中营养素的变化及微生物数量的动态变化；董周永等[3]以萝卜叶为原料，采用超声波辅助法提取叶绿素，其叶绿素平均得率为0.413%；Da-Hee Chung等[4-5]研究发现，萝卜叶中乙酸乙酯提取物具有抗氧化和抗癌功能，对自发性高血压小鼠的血压有调节作用[6]。但目前萝卜叶的总体利用率还很低，既造成了资源浪费又污染了环境。

传统的黄酮提取方法主要有浸提、回流提取法等，新兴的方法主要有微波辅助提取法、超声波辅助提取法与超临界萃取法等[7]，已有相关学者采用超声波辅助提取法分别从紫苏、辣椒、沙棘等植物叶子中提取总黄酮[8-10]，提取率分别为5.410%、4.730%、5.034%。本研究拟采用超声波辅助乙醇浸提法对萝卜叶中黄酮类化合物进行提取，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化提取工艺，并对萝卜叶总黄酮的抗氧化活性进行研究，为萝卜叶黄酮高效提取及其抗氧化剂的开发利用提供理论知识，为今后植物源产品的高值化开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

萝卜叶：于2015年11月中旬采自天津市武清区田水铺村，萝卜叶清洗后烘干，超微粉碎过80目筛，冷藏保存。

主要试剂：芦丁标准品购自北京化学试剂公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯，由天大科威试剂公司提供。

1.1.2 主要仪器设备

KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；7200型可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 萝卜叶黄酮的提取工艺流程

萝卜叶→干燥、粉碎→超声波处理→浸提→离心→过滤→黄酮提取液

操作要点：

（1）原料预处理：新鲜萝卜叶清洗、沥水后切成2 cm左右的小段，于65 ℃烘箱中烘干、粉碎过筛（80目），密封存储备用。

（2）提取：称取2 g萝卜叶粉于三角瓶中，按试验设计，加入一定量的乙醇溶液，用封口膜封好后置于超声波清洗仪中进行超声处理，超声波功率为1 130 W，频率为50 Hz，然后置于恒温水浴上浸提一定时间，于4 000 r/min 下离心10 min，得到萝卜叶黄酮提取液，进行总黄酮测定。

1.2.2 萝卜叶黄酮提取的单因素试验设计

以总黄酮提取率为指标，分别考察乙醇体积分数、超声波处理时间、料液比（m︰V）、浸提温度、浸提时间对提取率的影响。

1.2.2.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

料液比为1:10，超声波处理20 min，60 ℃浸提1 h，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%，观察乙醇浓度对黄酮提取率的影响。

1.2.2.2 超声波处理时间对黄酮提取率的影响

料液比为1:10，乙醇体积分数为60%，超声波处理时间分别为5、10、15、20、25 min，然后于60 ℃下浸提1 h，测定黄酮提取率，观察超声波处理时间对黄酮提取率的影响。

1.2.2.3 料液比（m∶V）对黄酮提取率的影响

料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，乙醇体积分数为60%，超声波处理均为20 min，60 ℃下浸提1 h，研究料液比对黄酮提取率的影响。

1.2.2.4 浸提温度对黄酮提取率的影响

料液比为1:10，乙醇体积分数为60%，超声波处理20 min，浸提时间1 h，浸提温度分别为40、50、60、70、80 ℃，考察浸提温度对黄酮提取率的影响。

1.2.2.5 浸提时间对黄酮提取率的影响

料液比为1:10，乙醇体积分数为60%，超声波处理20 min，在60 ℃浸提温度下分别浸提5、15、20、30、45、60、75、90 min，考察浸提时间对黄酮提取率的影响。

1.2.3 提取工艺的正交试验设计

单因素试验结果显示，经超声波处理后，浸提时间对提取率的影响不大，因此，选择乙醇浓度、超声波处理时间、料液比、浸提温度4个指标进行正交试验，设计四因素三水平的正交试验，因素及水平见表1。

表1 正交因素与水平表

1.2.4 黄酮类化合物的测定方法

采用硝酸铝络合分光光度法[14]。按公式（1）计算总黄酮提取率。

提取率（%）＝测量浓度×稀释倍数×提取液体积/材料粉末质量×100 （1）

1.2.5 萝卜叶黄酮抗氧化活性的测定

测定提取物对羟自由基及超氧阴离子的清除作用。对·OH清除作用参照文献[11]进行测定，对O2清除作用参照文献[12]测定。按公式（2）计算清除率。

式中：SA—清除率；A0—不加样品的吸光度；A1—加入样品的吸光度；A2—本底的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响

从图1可知，黄酮提取率先随乙醇浓度的增加而增加，当乙醇浓度为 60%时达到最高值，随后呈下降趋势。随着乙醇浓度的逐渐升高，醇溶性物质的溶出率也随之增加，所以黄酮提取率先呈现升高的趋势；乙醇浓度过高，一些醇溶性和脂溶性的杂质溶出量也逐渐增多，这些成分可能会与乙醇-水分子体系结合，与黄酮类化合物形成竞争，影响黄酮类物质的溶出，从而导致黄酮提取率下降[13]。所以选用浓度为50%、60%、70%的乙醇做正交试验。

图1 乙醇浓度对提取率的影响

2.1.2 超声波处理时间对提取率的影响

从图2可知，随着超声波处理时间的延长，黄酮提取率不断增大，20 min时达到最大值，随后总黄酮提取率呈下降趋势。延长浸提时间，有利于黄酮充分溶出；超声时间过长，醇溶性杂质的溶出量也会增加，对黄酮形成竞争性抑制，使总黄酮提取率下降[13]。综合考虑能源、提取效率及提取率等问题，进行正交试验时，超声波处理时间选择10、15、20 min。

图2 超声波处理时间对提取率的影响

2.1.3 料液比对提取率的影响

如图3所示，黄酮提取率先随料液比的增大而增大，当料液比为1:15时达到最大值，随后随着料液比的增加，总黄酮提取率呈下降趋势。提高料液比，有利于类黄酮充分的溶出及扩散；继续增加料液比，可能使一些极性较大的黄酮无法溶出[14]，也可能引起其他醇溶性物质的溶出[15]，因而黄酮提取率下降。综合考虑选择料液比 1:5、1:10、1:15进行正交试验。

图3 料液比对提取率的影响

2.1.4 温度对提取率的影响

如图4所示，在提取温度低于60 ℃时，随着提取温度的上升，黄酮提取率也随之增加，高于60 ℃后，黄酮提取率下降。这可能是由于随着温度的升高，黄酮在乙醇溶液中的溶解度增加；同时由于温度升高，分子运动加快，扩散速率增加，促使提取速度加快[16]。但是当温度过高，黄酮类物质容易被氧化，分子结构会遭到破坏。故本试验选择提取温度50、60、70 ℃进行正交试验。

图4 提取温度对提取率的影响

2.1.5 浸提时间对提取率的影响

如图5所示，初始阶段黄酮提取率呈上升趋势，浸提时间达到30 min时，出现峰值，随后呈下降趋势，但提取率总体变化不大，故不将提取时间作为正交试验的因素，提取时间固定为30 min。

图5 提取时间对提取率的影响

2.2 正交试验结果及验证试验

正交试验 L9（34）试验因素、水平及试验结果见表2。

表2 正交试验结果

由表2极差分析得出，影响黄酮提取率的因素顺序为：乙醇浓度＞料液比＞超声波时间＞浸提温度，最优提取工艺条件为 A2C3B2D1，即：乙醇浓度为60%，料液比为1:15，超声波处理15 min，在50 ℃条件下水浴浸提30 min。

以最优组合进行 5次重复性试验，黄酮的平均提取率为 1.41%，相对标准偏差 RSD值为1.06%，表明其重复性良好。

以本试验得到的最佳乙醇浓度（60%），料液比为（1:15），在50 ℃条件下，采用直接浸提法，提取时间（30 min），黄酮的提取率仅为0.67%。由此可见，超声波辅助处理可以显著提高黄酮的提取率。

2.3 黄酮提取物的抗氧化活性研究结果

采用正交试验的最优工艺条件提取萝卜叶黄酮，黄酮提取物对·OH和 O2-·的清除作用见表 3。由表3可以看出，萝卜叶黄酮对·OH和 O2-·均具有清除作用，且随黄酮浓度的增大清除率增加，在浓度3.0 mg/mL时清除率达100%，即在0.1～3.0 mg/mL范围内，清除率与黄酮的浓度存在着剂量效应关系。在同一浓度下，对·OH的清除率明显大于对 O2-·的清除率。这可能与黄酮类化合物的具体结构以及清除不同自由基的具体作用机理不同有关[15]。

表3 萝卜叶黄酮对·OH和 O2-·的清除作用

3 结论

以乙醇为提取剂，通过超声波辅助提取方法，筛选出萝卜叶黄酮的最优提取工艺条件为：乙醇浓度为60%，料液比为1:15，超声波处理15 min，在50 ℃条件下水浴浸提30 min。在此工艺下，萝卜叶黄酮提取率为 1.41%，明显高于直接浸提法（提取率为 0.67%）。萝卜叶黄酮对羟自由基·OH和 O2-·具有明显的清除作用，在一定剂量范围内，清除效果随着黄酮浓度的增加而增强。由于试验条件等因素的约束，对黄酮的构象未能给出结论，有待进一步研究。

[1] Noor E A. The impact of some factors on the inhibitory action of radish seeds aqueous extract for mild steel corrosion in 1 M H2SO4solution[J]. Materials Chemistry and Physics，2011，131（1/2）：160－169.

[2] 吴海清，何新益，孙贵宝. 萝卜叶酱菜加工过程中营养素的变化研究[J]. 现代食品科技，2015，31（1）：216－220.

[3] 董周永，周亚军，任辉. 萝卜缨叶绿素超声辅助提取工艺优化[J]. 农业工程学报，2011，27（增刊2）：288－292.

[4] Chung D H，Kim S H，Myung N，et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract of radish leaves in spontaneously hypertensive rats[J]. Nutrition Research Practice，2012，6（4）：308－314.

[5] Chang M J，Jeong D H，Park J H，et al. Anti-hypertensive potential of ethylacetate extract from radish leaves in spontaneously hypertensive rats [J]. The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2011，25（3）：291－296.

[6] Kim B R，Park J H，Kim S H，et al. Anti-hypertensive properties of dried radish leaves powder in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Nutrition and Health，2010，43（6）：561－569.

[7] 杜若源，谢晶，王婷，等. 超声波辅助提取银杏叶中总黄酮的工艺优化[J]. 食品与机械，2015，31（1）：167－170.

[8] 陈洪彬，郑金水，蔡英卿. 紫苏叶中总黄酮的超声波辅助提取工艺优化[J]. 食品与机械，2014，30（5）：232－236.

[9] 王艳丽，何煜波，曹晓宁，等. 辣椒叶中总黄酮提取工艺的优化[J]. 食品与机械，2013，29（3）：138－140.

[10] 李峰，刘浩，钟媛，等. 沙棘叶中总多酚和总黄酮的提取工艺[J]. 食品与机械，2012，28（4）：128－130.

[11] 刘爱敬，廖争争，郭琳，等. 大孔树脂纯化黄秋葵黄酮及其体外抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技，2015，36（16）：284－288.

[12] 程超，薛峰，李伟，等. 3种处理方式对葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基能力的影响[J]. 食品科学，2014，35（13）：26－31.

[13] 杨芳，杨万林，陈锦玉，等. 苦荞壳总黄酮超声辅助醇提工艺的优化[J]. 食品与机械，2015，31（5）：234－238.

[14] 郭辉，罗宇倩，章华伟，等. 响应面法优化超声波辅助提取荷叶黄酮工艺研究[J]. 中国食品学报，2011，11（1）：119－125.

[15] 郝教敏，李云，杨珍平，等. 红粒小麦粗类黄酮的水浴醇提工艺优化及体外抗氧化研究[J]. 中国粮油学报，2015，30（7）：12－18.

[16] 孙美，黄艳菲，赵小燕，等. 响应曲面法优化荞麦总黄酮的提取工艺[J]. 现代食品科技，2012，28（12）：1714－1718.

责任编辑：张爱婷

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Technology and Antioxidant Activities of Flavonoids in Radish Leaves

WU Hai-qing1,2, ZHEN Run-ying1,2,CorrespondingAuthor, HE Xin-yi1,2, SUN Gui-bao1,2
（1. College of Food Science and Biotechnology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China）

Total flavonoids were extracted from radish leaves using ethanol as extraction solvent with the aid of ultrasonic treatment. Five single-factor experiments with four factors triple orthogonal design was adopted to research the ultrasonic-assisted ethanol extraction process of flavonoids in the water bath. The scavenging abilities against hydroxyl radicals（·OH） and （O2-·） in vitro of flavonoids were determined. The results indicated that the optimum extraction parameters were as follows：the volum fraction of ethanol was 60%, solid-liquid ratio was 15（m:V）, ultrasonic treatment 15min, immerse 30 min under the temperature of 50 ℃ . Under these conditions, the extraction rate of total flavonoids is up to 1.41%, was the traditional extraction method of 200%. Flavonoids of radish leaves can effectively scavenge·OH and O2-·, and the role of these effect increased with the increase of flavonoids concentration, IC50were 0.643 8, 1.523 1 mg/mL. These results demonstrated that UAE was a highly effective way to extract flavonoids from radish leaves and the antioxidant activity of flavonoids was high.

radish leaves; flavonoids; ultrasonic wave; assisted; antioxidant

TS201.1

：A

2016-07-10

天津市农业科技合作项目“特色品牌青萝卜产业化配套新技术集成示范”（201410061027）

吴海清（1982－），女，天津市人，实验师，硕士，主要从事食品科学及生物工程方面的研究。E-mail：haiqing_w@yeah.net。

甄润英（1962－），女，天津市人，教授，硕士，主要从事食品加工及营养检测方面的研究。E-mail：zhenrunying@tjau.edu.cn。

1008-5394（2017）02-0063-04