乳制品中苯甲酸的色谱分析方法研究进展

张 强

（四川省轻工业研究设计院，成都 610081）

乳制品中苯甲酸的色谱分析方法研究进展

张 强

（四川省轻工业研究设计院，成都 610081）

苯甲酸是常用的食品添加剂，但被禁止应用于乳制品。乳制品中苯甲酸的来源可由天然马尿酸在乳酸菌等作用下转化而来，也可因人为添加而产生。过量苯甲酸可对人体造成损害。乳制品中苯甲酸的分析方法有高效液相色谱法、气相色谱法、LC-MS法、GC-MS法等。

苯甲酸；色谱；乳制品；分析方法

苯甲酸（Benzoic.acid）是“国际纯粹与应用化学联合会”食品法中最早允许添加的化学防腐剂之一。动植物中发现的天然苯甲酸主要以游离态（苯甲酸）或者化合态（苯甲酸酯）的形式存在。工业上苯甲酸最初是由安息香胶干馏或碱水水解制得，也可由马尿酸水解制得，现由钴、锰等催化剂催化氧化甲苯制得或由邻苯二甲酸酐水解脱羧制得。苯甲酸可穿透细菌细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，阻碍细胞膜对氨基酸的吸收，酸化细胞内储备碱，进而抑制微生物细胞内呼吸酶系活性，阻止乙酰辅酶A缩合反应，从而起到防腐作用。它既能抑制广谱范围微生物的繁殖，又具有良好的杀菌作用[1]。苯甲酸具有杀菌率高、毒副作用小、化学性能稳定等优点。

但由于过量摄入苯甲酸对人体有害，所以苯甲酸不能作为日常食品的乳制品添加剂使用，对此我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）有严格规定。但据国内调查表明，仍有少数不法商家向乳制品中添加苯甲酸，使多数居民对乳制品质量安全堪忧[2～4]。另外，研究证明，乳制品也存在着一定量的天然苯甲酸，由于乳制品中蛋白质含量高，机体复杂多变，严重干扰苯甲酸的分析检测。因此，研究乳制品中苯甲酸的分析方法，是准确判定该产品是否符合标准的重要手段。本文对乳制品中苯甲酸的来源及危害、乳制品中苯甲酸分析检测方法进行了综述，希望对乳制品中苯甲酸检测方法的发展有所帮助。

1 乳制品中苯甲酸的来源

1.1 天然来源

天然马尿酸在乳酸菌等作用下可以转化为苯甲酸，是乳制品中苯甲酸来源的主要途径（图1）。据马景友等[5]研究证明，鲜牛奶中苯甲酸的含量变化主要是由牛奶后期处理过程中受细菌污染、大量繁殖的细菌分解马尿酸转化成苯甲酸所致，这是天然牛奶中苯甲酸的主要来源。Sieber.等[6]报道，乳制品的发酵过程中在乳酸菌作用下，马尿酸脱甘氨酸生成苯甲酸，从而使酸牛乳中天然苯甲酸含量增加。谢国祥等[7]进一步研究证明，牛乳中马尿酸在乳酸菌存在的条件下3h后基本转化为苯甲酸。另外，乳制品（干酪）中苯甲酸的来源还可由苯甲醛氧化、苯丙氨酸降解、发酵芳香族氨基等途径产生[8]。

图1 马尿酸转化为苯甲酸

1.2 人为添加

为达到延长食品保存时间，增强感官性质，满足加工工艺过程的要求，国家允许在食品中加入少量合成或天然的化学物质。《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）允许苯甲酸及苯甲酸钠作为果蔬汁(浆)类饮料、蛋白饮料、碳酸饮料、茶等食品的添加剂，但禁止作为乳制品添加剂。由于苯甲酸生产成本低、易获得，少数不法商家将其滥用于乳制品，长期食用就会摄入过量苯甲酸，对人体造成危害。

1.3 其他来源

乳制品中苯甲酸来源还与添加剂种类和添加量有关。文献报道，饲料中的苯甲酸钠也能对生鲜乳中苯甲酸含量产生影响[9]。

2 摄入过量苯甲酸的危害

2.1 苯甲酸的代谢

2.2 苯甲酸的危害

在规定使用限量内，苯甲酸作为食品添加剂是安全的，但试验表明长期摄入含有苯中酸的食物会对身体产生危害。苯甲酸在肝脏内降解，肝功能衰弱的人摄入苯甲酸会使病情加重；常人摄入过量的苯甲酸会加重肝脏负担。苯甲酸可损伤线粒体DNA，导致细胞损伤，引起神经系统的症状，还可引起哮喘等过敏反应[11]。长期作用还可能引起人慢性苯中毒，产生神经衰弱如头晕、记忆力减退、乏力等症状[12,13]。此外，若过量摄取苯甲酸及其钠盐，将出现饮食量及体重减少、肠出血、肝脏和肾脏肥大等症状，并使肝脏中磷脂减少、骨骼中钙丢失、死亡率增加等[14]。

2.3 代谢物苯甲酸钠的危害

人体代谢可将苯甲酸转化为毒性更低的苯甲酸钠，但研究表明苯甲酸钠可以致使染色体断裂而引起癌变；还可能成为血管性水肿和反复发作的急性荨麻疹等疾病的诱因[15,16]。

2.4 与其他添加剂协同作用产生的危害

食品添加剂协同作用产生的危害表现为，共同作用致毒或相互反应生成新的有害物质。苯甲酸可能会在维生素C和重金属硫酸盐存在的条件下，反应形成具有致癌性的苯，对人体的细胞膜造成损害[17]。付佳[18]对苯甲酸钠与糖精钠、柠檬黄的体外联合毒性进行了研究，结果表明，苯甲酸钠+柠檬黄具有协同作用，这种效应可能与某些食品添加剂影响儿童的神经系统发育和改变行为有关；三种受试物单独及联合作用虽然没有氧化性损伤作用，但都能引起DNA的断裂损伤和.DPC增加。施春伟[19]研究证明，阿斯巴甜和苯甲酸钠联合使用会抑制BRL的细胞增殖，并使细胞周期阻滞在S期或者G0/G1期，增加细胞微核发生率、细胞坏死率和细胞调亡率；还会降低小鼠的体重。

3 乳制品中苯甲酸的分析方法

3.1 高效液相（HPLC）法

近几年，由于高效液相色谱具有灵敏度高、速度快、分辨率高、色谱柱可反复使用、样品量少且易回收等特点，逐渐成为乳制品中苯甲酸检测技术的研究热点，按照样品前处理技术的不同可分为以下几种方法：

3.1.1.沉淀法

该方法是在样品前处理过程中加入酸碱、重金属离子、有机物沉淀蛋白质，以排除蛋白质对检测的干扰。①酸碱沉淀法..该法依靠酸碱性使样品中蛋白质变性沉淀，达到消除干扰的目的。由于该方法污染严重、试剂消耗大、分离效果不理想而逐渐被其他方法替代。②无机重金属沉淀法..祝伟霞等[20]用醋酸锌-亚铁氰化钾作为沉淀剂，测定奶粉、酸奶和其他发酵乳制品的苯甲酸和山梨酸含量，样品加标回收率为87.4%～110.0%，吸收波在227nm时苯甲酸检测限为0.5µg/mL。王淼[21]报道用亚铁氰化钾-乙酸锌为沉淀剂，建立了高效液相色谱法同时测定乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、安赛蜜和糖精钠的方法，方法回收率在95.0%～103.0%，精密度(RSD)为1.70%～2.03%，检出限分别为1.5、1.5、1.5、2.5µg/g。李素琴等[22]建立了乳制品中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸等7种食品添加剂的高效液相色谱分析方法。样品处理后使用C18反相色谱柱分离，以甲醇-乙酸铵水溶液为流动相梯度洗脱，紫外检测器检测，检测波长230nm下的分离效果较好，回收率高。刘赐等[23]研究用金属盐、生物碱、有机溶剂作乳制品前处理剂，用高效液相色谱法测定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠，结果进一步证明金属盐沉淀剂效果好，能获得满意效果。③有机沉淀法..钱聪[24]对比乙酸锌-亚铁氰化钾沉淀法、乙酸沉淀法、甲醇沉淀法，证明与国标法相比，用乙酸和甲醇沉淀蛋白的方法操作简单，沉淀效果更好。孙伟等[25]用亚铁氰化钾-乙酸锌溶液、无水乙醇、硫酸铜溶液、硫酸铜-氢氧化钠溶液、高氯酸溶液处理乳制品样品，获得无水乙醇可替代质量浓度为106g/L亚铁氰化钾溶液和19g/L乙酸锌溶液的结论。

亚铁氰化钾溶液在使用过程中受热分解产生的氰化物有剧毒，而金属沉淀剂中含有大量的金属离子能影响色谱柱的使用寿命，所以不是最佳的选择方法，无水有机试剂作为沉淀剂则优于上述试剂，但也会污染环境、影响试验人员安全。

3.1.2.萃取法

萃取技术近年发展出许多新兴技术，如固相萃取、浊点萃取等，被用于乳制品样品前处理研究过程中。杨红梅报道[26]，使用PEP-SPE.6cc固相小柱吸附目标物，建立起固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶及蛋白类饮料中苯甲酸等10种防腐剂的方法，该方法的检出限在1.0mg/L～2.0mg/L，线性范围1.0mg/L～100.0mg/L，牛奶加标回收率在93.7%～114.4%，相对标准偏差在0.59%～4.84%（n=4）。侯文欣等[27]以非离子表面活性剂、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween-20)为萃取剂，建立了基于浊点萃取测定牛奶中苯甲酸的高效液相色谱法，最佳条件下R=0.9998，检出限为0.025µg/mL，加标回收率为98.90%～100.16%，SD为1.2%～2.5%。还有方法研究，用甲醇提取液态奶中的苯甲酸，用甲醇和三氯乙酸提取奶粉、酸奶中的苯甲酸，后用液相色谱方法分析，获得较为理想的结果[28]。

3.2 气相色谱（GC）法

气相色谱技术是目前使用较多、应用较早、运行简单可靠的一种分离分析方法，该技术能用于气体、有机物、部分无机物的分离分析。因此，也被广泛用于乳制品中苯甲酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯等食品添加剂含量的分析检测中。欧阳懿建立了气相色谱分析苯甲酸的方法，该方法分离度和重现性均较好[29]。.张红霞等[30]应用气相色谱技术，建立了液体乳及乳粉中山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯共7种防腐剂的定量分析方法，结果表明该方法前处理简单快速、检测效率高、线性范围宽、灵敏度高。高星等[31]报道用气相色谱法测定酸牛乳及含乳饮料中的苯甲酸、山梨酸，样品经醋酸锌-亚铁氰化钾沉淀，滤液经乙醚提取后上机测定，苯甲酸检出限为9.5×10-10g，精密度变异系数为2.8%，平均回收率为101.1%。

3.3 液相/气相色谱-串联质谱(LC/GC-MS)法

液相/气相色谱-质谱法，是一种集液相/气相色谱对复杂样品中目标物质有高效分离能力并具有质谱特异选择性和高灵敏度及分子信息于一体的现代分析技术，能为复杂样品的分离分析提供有效手段。胡桂林等[32]建立了GC-MS测定牛奶和奶粉中苯甲酸质量分数的方法，试验结果准确可靠，重复性好，灵敏度高，可以用于牛奶和奶粉中苯甲酸的检测。张鲁南等[33]报道了LC-MS测定牛奶中苯甲酸的方法，该方法快速、灵敏、特异性强。郭文丽等[34]研究使用液相色谱法（HPLC）同时测定乳制品中的马尿酸和苯甲酸，该方法具有良好的准确度、精密度和较高的重现性。但在使用此类高端分析仪器对复杂样品分析时，样品中往往可能含有与目标物质性质相似的物质，这些物质会干扰仪器分析造成假阳性或假阴性的检测结果。

4 总结与展望

乳制品中苯甲酸的天然来源，主要是由马尿酸在厌氧细菌作用下代谢产生。过量摄入苯甲酸能对人体产生危害，甚至致癌、死亡。因此，有效测定乳制品中苯甲酸的含量，是控制苯甲酸产生的重要前提手段。色谱法是分析乳制品中苯甲酸含量的主要方法，其中高效液相色谱法由于其独特的优势和特点成为研究的热点。但乳制品中蛋白质含量高，严重影响乳制品中苯甲酸的测定结果，如何提高乳制品样品前处理技术，成为准确分析苯甲酸含量的重要问题。目前，乳制品样品前处理方法有：沉淀法（酸碱沉淀法、重金属沉淀法、有机沉淀法）和萃取法，两者都存在一定程度的缺陷，还需深入探讨和研究。今后，需新建立能进一步满足低耗高效、方便准确、环保安全等要求的乳制品中苯甲酸含量的分析方法。

[1] 曾伟成,郑能武.苯甲酸钠对酪氨酸酶的抑制作用[J].数理医药学杂志,2000, 3(2):161.

[2] 汤颖梅,李福来,王怀明.中国居民乳制品消费的特点及发展趋势分析[J].江西农业学报,2010, 22(2):201-203.

[3] 李栋,范云琳,邵明.乳制品市场消费调查报告[J].中国食物与营养,2011,17(11):44-47.

[4] Sieber R, Butikofer U, Bosset J O, et al.Benzoic Acid as a Natural Component of Foods [J].Mitteilungen aus dem Gebiete der Lebensmitteluntersuchung und Hygiene,1989, 80:345-362.

[5] 马景友,吴九重,李洪波,等.牛乳中苯甲酸的来源及含量研究[J].中国乳业,2012,125:64-66.

[6] Sieber R, Bosset J O, Butikofer U. Benzoic Acid as a Natural Compound in Cultured Dairy Products and Cheese[J]. International Dairy Journal, 1995, 5:227-246.

[7] 谢国祥,吴丽莉,宋如森.乳制品中马尿酸的检测及其在发酵过程中动态变化研究[J].食品科学,2005,26(9):426-428.

[8] 马泽鑫,范勇,赵晓.浅谈牛乳中的天然苯甲酸[J].食品安全导刊,2015,18:146-147.

[9] 章慧,韩奕奕.饲料中苯甲酸钠向生鲜乳的迁移水平及转化规律[J].中国乳品工业,2016, 44(6):24-27.

[10] 《食品卫生学》编写组.食品卫生学[M].北京:中国轻工业出版社,1991,113.

[11] 王思文,巩江.防腐剂苯甲酸钠的药理及毒理学研究[J].安徽农业科学,2010,38(30):1672-1684.

[13] Donna M C,Angelina B, Alison C,et al. Food additives and hyperactive behaviour in 3-year-old and 8/9-year-old children in the community: a randomised, double-blinded, placebocontrolled trial [J].Lancet, 2007, 370(9598):1560-1567.

[14] 史贤明.食品安全与卫生学[M].北京:中国农业出版社, 2003,251-252.

[15] 吕娜,沈明浩.苯甲酸钠对小鼠骨髓细胞的致突变作坩研究[J].吉林农业大学学报,2006, 28(4):466-468.

[16] Nettis E, Coianardi M.C,Ferrannini A,等.苯甲酸钠诱发可重复的急性芬麻疹/血管性水肿:随机对照试验[J].世界核心医学期刊文摘皮肤病学分册,2005,3:59-60.

[17] Indications of the Possible Formation of Benzene from Benzoic Acid in Foods[J].Bundesinstitut fur Risikobewertung,2006,13.

[18] 付佳.苯甲酸钠与糖精钠、柠檬黄体外联合毒性的研究[D].广州:中山大学,2010.

[19] 施春伟.阿巴斯甜和苯甲酸钠联合作用的生物学效应及机理初步研究[D].杭州:浙江工商大学,2015.

[20] 祝伟霞,魏蔚,杨冀州,等.高效液相色谱法测定乳饮料和奶制品中苯甲酸和山梨酸[J].中国国境卫生检疫杂志,2005,28(5):280-282.

[21] 王淼,黄晓林.高效液相色谱法同时测定乳及乳制品中防腐剂和甜味剂[J].中国乳品工业,2010,38(11):41-52.

[22] 李素琴,赵贞,刘丽君,等.高效液相色谱法检测乳制品中7种添加剂[J].乳业科学与技术,2016,39(4):22-2.

[23] 刘赐,周金森,刘钰钗,等.HPLC测定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的前处理方法研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16(11):1315-1369.

[24] 钱聪.液态奶中防腐剂高效液相色谱前处理方法比较[J].食品研究与开发,2014,35(22):122-125.

[25] 孙伟,王荣荣,汪清美.HPLc测定中添加剂前处理方法的探讨[J].中国乳品工业,2015,43(2):57-59.

[26] 杨红梅,王浩,郭启雷,等.固相萃取-高效液相色谱法测定牛奶及蛋白类饮料中10种防腐剂[J].食品研究与开发,2011,32(5):123-125.

[27] 侯文欣,商闯,杨更亮,等.浊点萃取-高效液相色谱法检测牛奶中苯甲酸[J].中国食品添加剂,2010,4:277-280.

[28] 万鹏,赵贞,李翠枝,等.HPLC甲法检测乳品中对羟基苯酸酯类和纳他霉素[J].乳业科学与技术,2013,36(3):9-11.

[29] 欧阳懿.苯甲酸的气相色谱分析[J].轻工科技,2014,11:101-102.

[30] 张红霞,卢克刚,梁秀清,等.气相色谱法测定液体乳及乳粉中的7种防腐剂[J].中国乳品工业,2012,40(10):46-48.

[31] 高星,刘洪生.气相色谱法测定酸牛乳及含乳饮料中的苯甲酸、山梨酸[J].中国奶牛,2007,12:42-43.

[32] 胡桂林,赵源,常建军,等.气相色谱-质谱/质谱法测定牛奶和奶粉中的苯甲酸[J].中国乳品工业,2010,38(6):56-59.

[33] 张鲁南,张梦琪,周彬,等.LC-MS/MS法测定液态奶中苯甲酸[J].中国卫生检验杂志, 2010, 20(5):1034-1117.

[34] 郭文丽,汪晓冬,廖振宇,等.乳制品中马尿酸HPLC的测定[J].食品研究与开发,2015(6):77-79.

Research Progress on Chromatography Analytical Methods of Benzoic Acid in Dairy Products

ZHANG Qiang
(Sichuan Research and Design Institute of Light Industry, Chengdu 610081)

Benzoic acid is a kind of common food additive, which is widely added to the food. This paper systematically analyzed the source of benzoic acid and the damage to human body caused by excessive intake of it in dairy products. The high performance liquid chromatography (HPLC),gas chromatography,LC-MS,GC-MS etc method for the analysis of benzoic acid in dairy products were introduced.

Benzoic acid; Chromatography; Dairy products; Analytical method

TS252.1

A

1004-4264（2017）06-0045-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.06.011

2017-01-16

张强（1989-），男，汉族，硕士，长期从事分析化学相关领域研究。