从化合物—靶点作用网络的角度证实羌活抗炎镇痛的作用

郑春松+严培晶+付长龙+叶蕻芝+吴广文+李西海+刘献祥

【摘 要】目的：从化合物-靶点作用网络的角度，探讨羌活在治疗骨关节炎关节疼痛中的作用，从而揭示其抗炎镇痛作用。方法：从北京大学天然产物库中搜索羌活的化学成分，建立羌活化合物的分子数据集；以白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和诱导型一氧化氮合酶为骨关节炎疼痛的治疗靶点，利用分子对接和生物网络技术，构建羌活化合物-抗炎镇痛靶点作用网络，分析羌活抗炎镇痛的作用特点。结果：羌活抗炎镇痛的活性成分有32个化合物，主要为香豆素苷类和有机酸类；约59.38%的化合物能作用于1个靶点，仅有9.38%的化合物能作用≥3个靶点，其作用关系曲线遵循幂函数p（k）=

k-1.96233规律，反映了羌活抗炎镇痛存在“一对多，多对一”的非线性特点。结论：化合物-靶点作用网络直观显示了羌活的抗炎镇痛作用，并且，网络中的化合物为今后进一步的实验验证和骨关节炎关节疼痛治疗新药研发提供参考。

【关键词】 骨关节炎；羌活；抗炎镇痛；化合物-靶点作用网络；痹证

Verifying the Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Qianghuo from the Compound-target

Network Perspective

ZHENG Chun-song，YAN Pei-jing，FU Chang-long，YE Hong-zhi，WU Guang-wen，LI Xi-hai，LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective：To explore the role of qianghuo（Notopterygium inchum Ting ex H，T.Chang）in the treatment of osteoarthritis from the compound-target network perspective so as to reveal its anti-inflammatory and analgesic effects.Methods：The chemical constituents of qianghuo were searched from the natural product library of Peking University to establish the molecular data sets of qianghuo compounds.Taking interleukin-1β，interleukin-6，tumor necrosis factor-α and inducible nitric oxide synthase as therapeutic targets for pain in osteoarthritis and using molecular docking and biological network technology，a qianghuo compound-anti-inflammatory and analgesic target network was established to analyze the anti-inflammatory and analgesic effects of qianghuo.Results：There were 32 compounds in qianghuo as the active ingredients with anti-inflammatory and analgesic effects，which were mainly coumarin glycosides and organic acids.Approximately 59.38% of the compounds could act on one target and only 9.38% of the compounds could act on more than 3 targets.The correlation curves followed the power function p（k） = k-1.96233，which reflected that the analgesic and anti-inflammatory effects of qianghuo had the nonlinear characteristics of "one to many，many to one".Conclusion：Compound-target network intuitively shows the anti-inflammatory and analgesic effects of qianghuo，and compounds in the network provide reference for further experimental verification and drug development for the treatment of osteoarthritic pain.

【Keywords】 osteoarthritis；qianghuo；

anti-inflammatory and analgesic effects；

compound target network；bi syndrome

痹證是风寒湿等外邪侵袭人体，致使闭阻经络、气血运行不畅的一类疾病，临床表现为肌肉、筋骨、关节发生酸痛、麻木、重着、屈伸不利，甚至关节肿大灼热等[1]。其中，疼痛和肿胀为最常见的临床表现，严重影响了患者的生活质量[2]。由此，镇痛、抗炎消肿作用已成为评价药物治疗痹证疗效的重要指标，也成为治疗痹证的良好开端[1，3]。黄仰模等[4]通过《金匮要略》中对关节疼痛的论述，揭示了祛除风寒湿邪是关节痛的主要治法。因此，以具有祛风寒湿功效的中药为研究对象，从药效物质基础（活性成分）和靶点的角度，研究其抗炎镇痛的作用，将有助于中医药防治痹证的现代阐释。

羌活在《神农本草经》中被列为上品，是蠲痹汤、羌活地黄汤等名方的重要组成药物，其辛散祛风、味苦燥湿、性温散寒，具有祛风胜湿止痛的功效，主治风寒湿痹肢节疼痛[5-7]。现代研究表明，羌活水煎液具有显著的抗炎镇痛作用[8]，但是，其具体的活性成分和作用靶点未见报道。骨关节炎（osteoarthritis，OA）作为痹证的代表性疾病之一，临床治疗的主要目的之一即缓解关节疼痛[9]。因

此，本文以OA为痹证研究对象，基于计算机模拟方法[10-11]，从化合物-靶点相互作用的角度，研究羌活化合物-抗炎镇痛靶点的作用网络，以期进一步明确羌活抗炎镇痛的作用，为其治疗OA关节疼痛提供新依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 羌活分子数据集，OA抗炎镇痛相关的蛋白数据集。

1.2 实验设备 本文是基于Windows系统的计算模拟与数据建模平台Discovery Studio ?（简称DS）完成的。计算过程中除非特别说明，所选用的参数均为缺省值。所有计算工作皆在北京大学化学与分子工程学院计算机模拟实验室完成。

1.3 方 法

1.3.1 羌活和蛋白分子数据集建立 从北京大学天然产物库中下载羌活的化学成分[12]，共计96个。在DS模拟平台上，建立羌活分子数据集。根据治疗靶数据库（Therapeutic Target Database）[13]和文献[14-21]，确定与OA抗炎镇痛相关的白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）为研究靶点。在RCSB Protein Data Bank上[22]，分别下载其蛋白质-配体复合物晶体结构，其代码分别为3O4O、1ALU、2AZ5和3HR4。在DS模拟平台上，建立蛋白分子数据集。

1.3.2 羌活化合物-靶点作用网络构建 羌活分子集配体与抗炎镇痛相关靶点在DS软件的LigandFit模块中进行分子对接[23]。具体如下：蛋白结构去溶剂、去配体、加氢处理后，以其所含的活性原配体来确定活性位点；在“Input Ligands”模块中输入羌活分子集的sd文件。使用蒙特卡罗方法对配体进行构象采样、Dreiding力场下进行打分，保留得分最高的构象，对对接成功的配体DOCK-SCORE进行排序。大于原配体DOCK-SCORE的配体，视为羌活抗炎镇痛的活性成分[24]。将上述化合物与靶点当作节点，两者相互作用用边表示。采用Cytoscape软件构建羌活化合物-靶点作用网络[25]。通过该软件的Plugins面板下Network Analysis分析羌活中化合物与靶点的作用情况。此外，定义度分布p（k）为网络中节点度值为k的概率[26]，由此得到网络度的分布情况，来揭示羌活抗炎镇痛的作用特点。

2 结 果

2.1 羌活抗炎镇痛的化合物 本文以IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS为抗炎镇痛的虚拟药理筛选模型，以各自蛋白结构上的配体抑制剂DOCK-SCORE为阈值，从羌活中筛选出与IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS结合较好的化合物分别为27，12，8，2个，见表1。结果显示了羌活抗炎镇痛的活性成分主要为香豆素苷和有机酸类化合物。

2.2 羌活活性成分和炎性靶点关系 构建了羌活的化合物-靶点作用网络，见图1。结果显示，网络中有36个节点（包括4个靶蛋白节点和32个化合物节点），大部分化合物节点位于网络的周边，仅能与一个靶蛋白节点连接，而仅有少数的化合物节点位于中心，可以与多个靶蛋白节点连接。由此通过Network Analysis模块分析了化合物-靶点作用网络中重要节点的网络特征，见表2。结果显示，羌活作用的关键靶点为IL-1β、IL-6和TNF-α，其关键的活性成分为UNPD126568、UNPD191127、UNPD70991、UNPD79883等，均为香豆素类成分。

2.3 羌活活性成分抗炎镇痛的作用特点 为了进一步分析羌活的化合物-靶点作用网络，本文计算了该网络化合物节点度的分布，见图2。结果发现约59.38%的化合物能作用于1个靶点，仅有9.38%的化合物能作用≥3个靶点，其化合物-靶点的作用关系曲线遵循幂函数p（k）=k-1.96233规律，反映了羌活中化合物与靶点的作用具有“一对多，多对一”的非线性特点。

3 讨 论

OA的主要临床表现为关节疼痛，即炎性疼痛和神经病理性疼痛。前者主要是炎症细胞因子引起的炎症所致，后者是炎症细胞长时间刺激骨关节周围的末梢神经所致。由此目前学者普遍认为，OA关节疼痛原因是炎症细胞因子通过直接或间接的途径诱导痛觉过敏引起[14]。有研究显示，IL-1β可以直接作用于周围痛觉感受器，产生痛敏，而且，阻断IL-1β的产生可以起到抗炎镇痛的作用[16-17]。IL-6在OA的疼痛传递中起到关键的作用，可增加TNF-α受体的表达[18]。TNF-α在软骨细胞或滑膜细胞中能诱导脊髓和背根神经节内IL-6的上调和神经病理性疼痛[19]。此外，iNOS特异性抑制剂可以产生镇痛作用，其表达与炎性疼痛的维持阶段有关[20-21]。因此，本文以IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS为OA抗炎镇痛的虚拟药理筛选模型。

由于中药有效成分多为小分子物质，是通过与体内的生物靶点相互作用产生药效的，这种作用可以通过分子模拟来计算[27]。近年来，基于分子模拟的网络药理学已经成为从中药中发现活性化合物以及探讨其作用机制的重要手段[28-29]。由此本文构建了羌活抗炎镇痛的化合物-靶点作用网络，其网络节点的度和介数被用于评价化合物和靶点在网络中的重要性[29]。从化合物的网络特征看，羌活中大部分化合物只能作用1个靶点，仅有少数可以作用多个靶点，最大数目达到4个。表2显示了度和介数值前3位的化合物节点为UNPD126568、UNPD191127和UNPD70991，屬于香豆素苷。提示羌活抗炎镇痛的药效物质基础为活性成分群，起到关键作用的是香豆素苷类化合物，可溶于水，与文献报道羌活水煎液具有抗炎镇痛作用相互印

證[8]，是未来从羌活中开发治疗OA关节疼痛的“混杂药物（promiscuous drugs）”的重要来源[30]，也是未来提取分离活性实验重点关注的部位。从靶点的网络特征看，表2显示了度和介数值前3位的靶点节点为IL-1β、IL-6和TNF-α，提示羌活的关键作用靶点为IL-1β、IL-6和TNF-α，其抗炎镇痛作用机制可能与抑制炎症细胞因子直接或间接诱导痛觉过敏有关。在一定层面上反映了羌活在OA关节疼痛治疗中的应用价值。

总之，本文以化合物-靶点相互作用为切入点，直观显示了羌活化合物与抗炎镇痛靶点的非线性作用特点，既预测了羌活治疗OA关节疼痛的活性成分，又明确了其作用靶点。未来将提取羌活的香豆素苷类成分，以大鼠膝OA和IL-1β诱导的退变关节软骨细胞为模型[31-32]，开展“中药-有效部位-有效成分-临床表型”的系统层次研究，进一步验证羌活的抗炎镇痛作用，为从羌活中开发OA关节疼痛的治疗新药提供新依据。

4 参考文献

[1] 冯兴华.痹证的概念与病机[J].首都医药，2001，8（9）：52-53.

[2] 熊颖，冯慧，宋宁.浅析痹证之疼痛[J].河南中医，2012，32（1）：10-12.

[3] 王莎莎，沈鹰.痹证三方镇痛抗炎消肿作用的实验研究[J].四川中医，2012，30（10）：38-40.

[4] 黄仰模，闵晓莉，赵诗哲，等.对《金匮要略》关节疼痛的探讨[J].中医药学刊，2004，22（4）：581.

[5] 杨林林，李福安，魏全嘉.羌活临床应用的研究概

况[J].青海医药杂志，2009，39（7）：91-93.

[6] 康武林，袁普卫，李小群，等.口服蠲痹汤和盐酸氨基葡萄糖胶囊治膝骨关节炎的疗效观察及作用机制研究[J].中医正骨，2016，28（9）：19-22.

[7] 陈朝蔚，孙剑，李玉梅，等.羌活地黄汤对胶原诱导的大鼠关节炎骨软骨连接的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2013，21（12）：8-10.

[8] 易增兴.羌活与独活水煎液的抗炎镇痛作用[J].宜春学院学报，2013，35（3）：68-70.

[9] 李文，陆涛，任杰，等.膝骨关节炎疼痛的治疗及临床疗效观察[J].实用骨科杂志，2011，17（12）：1142-1144.

[10] 郑春松，严培晶，付长龙，等.基于分子对接的独活寄生汤治痿和治痹药效物质基础研究[J].风湿病与关节炎，2017，6（3）：8-11.

[11] Zheng CS，Xu XJ，Ye HZ，et al.Computational approaches for exploring the potential synergism and polypharmacology of Duhuo Jisheng Decoction in the therapy of osteoarthritis[J].Mol Med Rep，2013，7（6）：1812-1818.

[12] Gu J，Gui Y，Chen L，et al.Use of Natural Products as Chemical Library for Drug Discovery and Network Pharmacology[J].PLoS One，2013，8（4）：e62839.

[13] Zhu F，Shi Z，Qin C，et al.Therapeutic target database update 2012：a resource for facilitating target-oriented drug discovery[J].Nucleic Acids Res，2012，40（Database issue）：D1128-D1136.

[14] 姚志华，袭敏蕾，樊天佑.炎症细胞因子在骨性关节炎疼痛中的作用机制[J].中国骨与关节杂志，2014，3（5）：374-377.

[15] 李勇光，郑婧，高宇，等.臭氧对骨性关节炎实验兔软骨细胞iNOS及MMP1表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2012，34（6）：472-473.

[16] Binshtok AM，Wang H，Zimmermann K，et al.Nociceptors are interleukin-1beta sensors[J].J Neurosci，2008，28（52）：14062-14073.

[17] Liang DY，Li X，Li WW，et al.Caspase-1 modulates incisional sensitization and inflammation[J].Anesthesiology，2010，113（4）：945-956.

[18] Kawasaki Y，Zhang L，Cheng JK，et al.Cytokine mechanisms of central sensitization：distinct and overlappingrole of interleukin-1beta，interleukin-6，and tumor necrosis factor-alpha in regulating synaptic and neuronal activity in the superficial spinal cord[J].J Neurosci，2008，28（20）：5189-5194.

[19] Lee KM，Jeon SM，Cho HJ.Tumor necrosis factor receptor 1 induces interleukin-6 upregulation through NF-kappa B in a rat neuropathic pain model[J].Eur J Pain，2009，13（8）：794-806.

[20] 李其，洪炎国.一氧化氮在炎性疼痛中的作用[J].生命科学，2007，19（4）：423-426.

[21] LaBuda CJ，Koblish M，Tuthill P，et al.Antinociceptive activity of the selective iNOS inhibitor AR-C102222 inrodent models of inflammatory，neuropathic and post-operative pain[J].Eur J Pain，2006，10（6）：505-512.

[22] Deshpande M，Addess KJ，Bluhm WF，et al.The RCSB Protein Data Bank： a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema[J].

Nucleic Acids Res，2005，33（Database issue）：

D233-D237.

[23] Montes M，Braud E，Miteva MA，et al.Receptor-based viral ligand screening for the identification of novel CDC25 phosphatase inhibitors[J].J Chem Inf Model，2008，48（1）：157-165.

[24] 鄭春松，徐筱杰，叶蕻芝，等.青风藤治疗骨性关节炎药效物质基础多靶导向作用的计算机模拟研

究[J].中国中西医结合杂志，2012，32（3）：375-379.

[25] Smoot ME，Ono K，Ruscheinski J，et al.Cytoscape 2.8： new features for data integration and network visualization[J].Bioinformatics，2011，27（3）：431-432.

[26] 王林，戴冠中.复杂网络的度分布研究[J].西北工业大学学报，2006，24（4）：405-409.

[27] Blaney JM，Dixon JS.A good ligand is hard to find：automasted docking methods[J].Perspectives in Drug Discovery and Design，1993，1（2）：301-319.

[28] Zheng C，Qiu M，Xu X，et al.Understanding the diverse functions of Huatan Tongluo Fang on rheumatoid arthritis from a pharmacological perspective[J].Exp The Med，2016，12（1）：87-94.

[29] 郑春松，黄绥心，叶蕻芝，等.从网络药理学角度研究白芍治疗 类风湿关节炎的作用[J].风湿病与关节炎，2017，6（5）：11-15，34.

[30] Bastos LF，Coelho MM.Drug repositioning：playing dirty to kill pain[J].CNS Drugs，2014，28（1）：45-61.

[31] 陈后煌，邵翔，马玉环，等.独活寄生汤通过miRNAs调控炎症性骨关节炎软骨细胞功能改变的机制探讨[J].风湿病与关节炎，2015，4（9）：55-59.

[32] 刘献祥，李西海，周江涛.改良Hulth造模法复制膝骨性关节炎的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2005，25（12）：1104-1108.

收稿日期：2017-01-05；修回日期：2017-04-10