清气化痰汤对哮喘小鼠肺部炎症的影响

陈 竹，彭 玉，庞 平，杨见辉，罗贞清

(贵阳中医学院第二临床医学院儿科，贵阳 550001)

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.006

清气化痰汤对哮喘小鼠肺部炎症的影响

陈 竹，彭 玉，庞 平，杨见辉，罗贞清

(贵阳中医学院第二临床医学院儿科，贵阳 550001)

目的观察清气化痰汤对哮喘小鼠气道炎症和肺组织炎性反应的干预作用。方法将45只BALB/c小鼠分为正常对照组(CON组)、哮喘模型组(MOD组)、地塞米松组(TRE组)、清气化痰汤组(X1组)、清气化痰汤联合地塞米松组(X2组)。通过卵清清蛋白和氢氧化铝凝胶进行致敏和雾化建立哮喘小鼠模型。取支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数、嗜酸性粒细胞计数及观察肺组织病理变化。结果与CON组比较，MOD组BALF 细胞计数和嗜酸性粒细胞计数明显增多，TRE组、X1组、X2组BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数均明显减少，TRE组和X2组治疗后第15天与第5天比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；各治疗组均能减轻小鼠肺组织病理炎性浸润，减少肺大泡产生、气道上皮增厚，X2组炎症损伤轻。结论清气化痰汤能减轻气道炎症，改善模型小鼠的肺组织炎性反应。

哮喘；炎症;清气化痰汤

哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，其以气道炎、气道高反应性、气道重塑为特征[1]。哮喘是一个全球性的疾病，其发病率呈逐年增高的趋势[2]。儿童是哮喘的高发人群，我国第3次全国儿科哮喘流行病学调查结果显示，全国0～14岁儿童哮喘患病率为0.42%～5.73%，平均为3.02%，较10年前增加了53.3%[3]。很多研究证实哮喘的发生及严重程度与嗜酸性粒细胞性气道炎症有关[4]。清气化痰汤是全国名老中医黄建业教授治疗哮喘痰热壅肺的经验方，临床疗效确切。本研究通过建立哮喘小鼠模型，观察清气化痰汤对哮喘模型小鼠肺部炎症和肺组织病理炎性损伤的影响，探讨其对哮喘的防治作用，为临床推广名老中医经验方及进一步研究其作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 BALB/c小鼠，雌性，4～6周龄，SPF级[合格证号SYXK(黔)2012-001]，购自贵州省实验动物工程中心。

1.2仪器与试剂 2%氢氧化铝凝胶购自Invivo Gen公司；卵清清蛋白(OVA)购自Sigma公司；注射用地塞米松磷酸钠购自马鞍山丰原制药有限公司，每支5 mg(批号150512-1)。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Masson 染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3药物 清气化痰汤由胆南星、全瓜蒌、法夏、浙贝、枳壳、陈皮、茯苓、杏仁等10味中药组成。

1.4方法

1.4.1造模方法 第1、8、15天腹腔注射OVA及氢氧化铝凝胶混合液0.2 mL(内含OVA 60 μg及2.25 mg氢氧化铝凝胶)致敏；第21天开始用5% OVA溶液8 mL行超声雾化，每次30 min，连续雾化5 d进行激发，建立动物模型。CON组用生理盐水代替OVA进行致敏和雾化。每天观察小鼠一般情况，并称取各组小鼠的体质量。

1.4.2分组及给药 将45只小鼠采用随机数字表法分为5组，每组9只：(1)正常对照组(CON组)，用生理盐水代替OVA进行致敏和雾化，不给药；(2)哮喘模型组(MOD组)，按1.4.1方法进行致敏和激发，不给药；(3)地塞米松组(TRE组)，按1.4.1方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)；(4)清气化痰汤组(X1组)，按1.4.1方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min灌胃给予中药0.3 mL；(5)清气化痰汤联合地塞米松组(X2组)，按1.4.1方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min灌胃给予中药0.3 mL，腹腔注射地塞米松(0.25 mg/kg)，每天1次，连续15 d。1 mL药液相当于 5.4 g生药。

1.4.3BALF细胞计数 于治疗后第5、15天每组各处死小鼠3只，同时从气管注射无菌生理盐水0.5 mL入肺，抽吸3次后将抽出液体即支气管肺泡灌洗液(BALF)冻存于-20 ℃；取150 μL BALF细胞悬液与细胞计数液按1∶1稀释混匀，显微镜下计数细胞总数，余下BALF 4 ℃、2 000 r/min离心10 min，取沉淀物涂片，瑞氏染色后在显微镜下观察，每个标本计数200个细胞，共观察10个视野计数。

1.4.4肺组织病理观察 处死小鼠后，取右肺置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，HE染色，每张切片随机选取左、右、上、中、下5个视野，观察各组小鼠肺组织病理变化。

2 结 果

2.1小鼠一般情况及体质量观察 (1)在致敏阶段，各组小鼠一般情况均较好，无明显差别；开始激发后，MOD、TRE、X1组和X2组小鼠均出现烦躁、精神萎靡、进食减少等变化，各组间无明显差异。(2)MOD组小鼠体质量较CON组下降，其他治疗组小鼠体质量介于二者之间(图1)。

图1 各组小鼠体质量变化

2.2各组小鼠BALF 细胞计数和嗜酸性粒细胞计数 与CON组比较，MOD组BALF 细胞计数和嗜酸性粒细胞计数明显增多(P<0.05)；TRE组治疗后第5天与第15天BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数无明显差异(P>0.05)；X1组在治疗15 d后BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数较治疗第5天时明显减少，其治疗效果有明显差异(P<0.05)；X2组治疗后第5天与第15天BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数比较也有明显差异(P<0.05)；3个治疗组中X2组治疗5 d与15 d后BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数下降最为显著(表1)。

表1 BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数

#：P<0.01，与CON组比较；*：P<0.05,**：P<0.01，与MOD组比较

A：CON组;B：MOD组;C：TRE组;D：X1组;E：X2组

图2治疗5 d后各实验组肺组织病理变化(HE×200)

A：CON组;B：MOD组;C：TRE组;D：X1组;E：X2组

图3治疗15 d后各实验组肺组织病理变化(HE×200)

2.3肺组织病理观察 (1)治疗5 d后肺组织病理观察：CON组小鼠肺组织结构正常，肺泡、小血管、支气管等结构完整，气管壁和肺泡周围无炎症细胞浸润；MOD组肺组织中肺大泡形成，肺充血，肺泡内出现泡沫样渗出物，间质水肿，可见淋巴细胞、单核细胞浸润，肺组织中气道上皮增厚，管腔狭窄，肺间质出现淋巴细胞和嗜酸细胞浸润；TRE和X1组肺泡间质炎症较重，肺泡间隔增宽，可见淋巴细胞、单核细胞浸润，肺泡内可见炎性渗出物；X2组小鼠肺部炎症减轻，肺泡结构完整，肺间质可见少量淋巴细胞和嗜酸细胞浸润(图2)。(2)治疗15 d后肺组织病理观察：CON组小鼠肺组织结构正常，肺泡、小血管、支气管等结构完整，气管壁和肺泡周围无炎性浸润；MOD组小鼠肺组织炎症减轻，部分可见肺充血，肺泡内出现泡沫样渗出物，间质水肿，可见淋巴细胞、单核细胞浸润，肺组织中气道上皮增厚，管腔狭窄，肺间质出现淋巴细胞和嗜酸细胞浸润；TRE和X1组肺泡间质仍有炎症，肺泡间隔增宽，可见淋巴细胞、单核细胞浸润，肺泡内可见炎性渗出物；X2组小鼠肺部炎症进一步减轻，肺泡结构完整，肺间质可见少量淋巴细胞和嗜酸细胞浸润(图3)。

3 讨 论

祖国医学中虽没有支气管哮喘的病名，但在《素问·逆调论》、《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气篇》已经有类似哮喘的记载，《诸病源侯论·咳嗽病诸侯》就提出“呷嗽者，犹是咳嗽也，其胸膈痰饮多者，嗽则气动于痰，上搏咽喉之间，痰气相击，随嗽动息，呀呷有声，谓之呷嗽”，所描述症状与支气管哮喘相符。儿童哮喘的发病率高与儿童的生理病理密切相关。小儿肺脏娇嫩，脾常不足，肾常虚。人体水液的正常代谢为肺脾肾三脏所司，若三脏功能失调，则致水液代谢失常，痰浊内生。如因外邪犯肺或感触异物、吸入异气，肺治节无权，水津失于输布，凝液为痰；儿童脾常不足，脾虚不能为胃行其津液，运化失司，湿聚为痰，上贮于肺；肾气虚衰，不能蒸化水液，也能使水湿上泛为痰。临床不论何种证型均表现为咳嗽气喘，喉间痰鸣。中医认为痰易生并伏储于气道是哮喘发作的病理基础，痰易生难消成为治疗哮喘的一个难点。结合现代医学对哮喘病因病理机制的认识，推测哮喘“痰饮伏肺”的中医病理特征与现代医学哮喘气道炎症、气道重塑存在必然的联系[5]。

清气化痰汤是本院国家级名老中医黄建业教授治疗痰热咳喘的经验方，由胆南星、全瓜蒌、法夏、浙贝、枳壳、陈皮、茯苓、杏仁等10味中药组成。胆南星、全瓜蒌共为君药，可疏泄实痰实火之壅闭，宽胸散结，达到清化肺内痰热，理气止咳目的。法夏为辛温之品，与苦寒之黄芩、浙贝相配共为臣药，一化痰散结，一清热降火，既相辅、相制又相成；佐以杏仁降利肺气以宣上，枳壳、陈皮理气化痰以宽胸；茯苓健脾渗湿以杜生痰之源；焦楂消积以助脾运。全方具有清热化痰、止咳平喘的作用。

本研究采用药物激发制造小鼠哮喘模型，在进行激发后除CON组小鼠外，其余各组小鼠均出现烦躁、精神萎靡、进食减少、体质量下降等变化，尤其是MOD组小鼠体质量持续下降明显。提示哮喘作为一个慢性气道炎症，可对患者的精神及体格生长造成影响，这对处于生长发育时期的儿童危害更大。大量研究表明，炎症在哮喘的发病中发挥着至关重要的作用，肺组织的嗜酸性粒细胞能够介导气道高反应性、气道重塑等病理改变[6-8]。本研究发现TRE组在治疗后5 d BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数较X1组低，但组内比较，治疗5 d与15 d后BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数无明显差异，说明激素治疗在疾病早期可较快抑制炎性反应，但随着治疗时间的延长其治疗效果并未明显增强。X1组在治疗5 d后虽然BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数都较TRE组高，但在治疗15 d后其治疗效果有明显差异，上述数值均随着药物持续给予逐渐下降，接近激素治疗效果，说明清气化痰汤在抑制炎症介质释放方面虽然起效慢，但随着治疗时间的延长治疗效果逐渐增强。X2组在治疗5 d与15 d BALF细胞计数和嗜酸性粒细胞计数均低于TRE、X1组，且组内比较有明显差异，提示清气化痰汤与激素在减少炎症介质释放、控制炎性反应方面有协同治疗作用。

气道的炎症和气道功能受损，二者存在密切联系，支气管气道的炎症主要表现在嗜酸细胞的增多及浸润，而支气管气道功能受损主要表现为上皮结构和功能改变[9]。本研究建立的哮喘模型均出现了气道炎症和功能的受损。有研究指出气道结构和功能的改变是支气管哮喘病理改变的核心环节，气道上皮可以促使Th2细胞因子表达增加[10]，这些细胞因子对成熟嗜酸细胞具有趋化和激活作用，直接参与了哮喘的发病和气道炎症的形成[11-12]。本研究发现X1组的病理改变轻，无肺大泡、气道上皮未增厚，说明清气化痰汤的治疗作用不仅是抑制嗜酸细胞等炎症介质的释放还在维护气道上皮的完整性、调节免疫方面有积极作用。X2组小鼠肺组织病理示炎症较X1、TRE组轻，肺泡结构完整，肺间质仅见少量淋巴细胞和嗜酸细胞浸润。说明清气化痰汤在减轻小鼠肺组织炎症浸润方面疗效与激素相似，并且在与激素联合使用时能明显修复肺组织的病理损伤。

通过研究证实，清气化痰汤治疗哮喘、减轻咳喘痰鸣症状的作用机制是抑制炎症介质的释放，减少肺组织中炎性渗出，减轻肺组织损伤。但清气化痰汤与激素联合使用能更好地保护肺组织的机制，需要进一步实验研究。

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EffectofQingqihuatanDecoctiononpulmonaryinflammationinasthmaticmouse*

ChenZhu，PengYu，PangPing，YangJianhui，LuoZhengqing

(DepartmentofPediatrics,SecondClinicalMedicalCollege,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550001，China)

ObjectiveTo observe the interventional effect of Qingqihuatan Decoction on airway inflammation and inflammatory reaction of lung tissue in asthmatic mouse.MethodsForty-five BALB/c mice were randomly divided into the normal control group(CON),asthmatic model group(MOD),dexamethasone group(TRE),Qingqihuatan Decoction group(X1) and Qingqihuatan Decoction combined dexamethasone group(X2).The asthmatic mouse model was established by the sensitization and inhalation of OVA and aluminium hydroxide gel.The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was performed the cell counts and eosinophil counts,and the pathological changes of lung tissue were observed.ResultsCompared with CON group,BALF cell count and eosinophil count in the model group were increased obviously,which in the treatment group were significantly decreased.The effect of the X1 group and X2 group had statistical difference between on 5 d and 15 d.(P<0.05 orP<0.01);the treatment groups could reduce the pathogenical infiltration,lung bullae production and airway epithelial thickening of mouse lung tissue,especially the inflammation damage in X2 group was mild.ConclusionQingqihuatan Decoction can relieve the airway inflammation and improves the lung tissue inflammatory response in model mouse.

asthma;inflammation;Qingqihuatan Decoction

R272

A

1671-8348(2017)25-3473-04

2016-12-18

2017-06-06)

贵州省科学技术资金资助项目(黔科合LH字[2014]7314号)；贵州省卫生和计划生育委员会科学技术基金资助项目(gzwjkj2014-2-124)。

陈竹(1976-)，硕士，副教授，主要从事儿童呼吸系统疾病的中西医结合防治研究。