黄连种子后熟过程中抗氧化酶活性动态变化的研究

罗婷婷，马云桐，裴瑾，邹玉霞，周碧乾，钟芙蓉

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黄连种子后熟过程中抗氧化酶活性动态变化的研究

罗婷婷，马云桐，裴瑾，邹玉霞，周碧乾，钟芙蓉

目的：探讨黄连种子在后熟过程中抗氧化酶活性的动态变化。方法：分别以4 ± 1 ℃（低温）和18 ± 1 ℃（常温）进行层积处理黄连种子，测定黄连种子的抗氧化酶活性。结果：黄连种子后熟过程中，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA) 含量总体呈上升趋势。低温处理种子中过氧化物酶(POD)含量显著高于常温处理，其余抗氧化酶活性无显著差异。结论：黄连种子通过各抗氧化活性酶相互作用，在种子后熟过程中有效地消除活性氧对细胞结构完整性的影响，并促进黄连种子的形态和生理后熟，从而保证种子顺利萌发。

黄连种子；后熟；抗氧化酶；动态变化

种子在层积处理过程中受到周围环境中氧气、水分等的影响。种子体内产生的O2-(或HO2-)、OH•及其活性衍生物等自由基活性氧，包括H2O2，ROOH等，它们攻击膜体系中的不饱和脂肪酸，导致过氧化过程，并产生最终产物丙二醛[1]。二者均能严重的损伤细胞膜，导致种子失活。但种子同时存在膜保护系统，能够清除体内多余的自由基，其活性氧自由基代谢是一个动态的变化过程，这一保护酶系统实际上是一个抗氧化系统[2]，它是由许多酶和还原型物质组成，其中过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)是主要的抗氧化酶，可清除体内有害的活性氧，则有利于清除种子内因脂质过氧化而产生的毒害，保护植物膜系统，同时有研究表明种子内部存在的抗氧化防御系统，可加速储藏物质的分解，为新细胞原生质的构成提供能量[3]。因此，它们的活性高低与种子活力高低密切相关，直接关系到种子是否能完成后熟。

野生黄连分布于湖北、湖南、四川、重庆、甘肃、贵州省海拔1200-1700m的山谷密林之中，由于过度采挖，资源濒临灭绝，大多人工栽培，由于黄连种子体积小，对生长环境要求严格，自身要经过9个月左右的形态后熟和生理后熟过程才能萌发等特点[5-6]。本实验通过测定黄连种子在后熟过程中抗氧化酶活性的变化，研究结果对于完善黄连种子的休眠机理，探索解除种子休眠的方法提供理论参考依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

黄连种子于2016年5月底采集于四川省雅安市天全乡小沟村，经成都中医药大学马云桐教授鉴定为毛茛科植物黄连（Coptis chinensisFranch.）的种子。

1.2 实验仪器

RZH-0450型低温人工气候箱（杭州会儿仪器设备有限公司）、全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser-48上海净信科技）、离心机（Hitachi centrifuge CT15RE）、移液枪（eppeudorf Research plus）、酶标仪(Thermo scientificTM varioskanTM FLASH) 、96孔板、2 mL EP管等。

1.3 试剂试药

丙二醛（MDA）、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。

2 实验方法

2.1 种子层积处理

模拟自然环境，将种子与湿沙（湿沙以手握成团落地即散为度，保持良好的通气并检查基质含水量）按重量1:4～1:6 比例混合，置于18 ± 1 ℃低温人工气候箱层积110 d后，将种子分为2份，1份原条件下继续层积70 d（常温层积）；另一份转移至4 ± 1℃低温人工气候箱层积70 d（温层积）。在层积过程中每隔10 d分别取样，将种子用清水洗净，晾干种子表面水分，以备测试。

2.2 抗氧化系统酶活性测定及丙二醛(MDA)的测定

每隔10d分别测定种子中丙二醛（MDA）含量及过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD)活性，按照试剂盒说明书进行测定，每个指标3次重复取平均值。

3 数据分析

实验数据采用 Excel 2010 进行统计、绘图，采用SPSS 22.0软件进行方差分析，计算标准差、检验差异显著性。

4 结果与分析

4.1 不同层积处理黄连种子过氧化物酶（POD）活性变化

从图1中可以看出，黄连种子在两种层积处理过程中，POD 活性总体来看呈现上升趋势，层积处理130 d后呈显著上升趋势；且两种层积处理过程中种子的POD活性变化趋势保持高度一致；低温处理种子中POD含量显著高于常温处理。方差分析结果表明，两种层积处理中，对照（0 d）与层积180 d的POD活性差异显著。

图1 不同层积处理黄连种子过氧化物酶（POD）活性变化

4.2 不同层积处理黄连种子过氧化氢酶（CAT）活性变化

由图2中可以看出，黄连种子在两种层积处理过程中，CAT 活性总体来看呈现上升趋势；随着层积时间的延长，其含量呈现坡度式的增减。且两种层积处理过程中种子的CAT活性变化趋势保持高度一致。方差分析结果表明，两种层积处理中对照（0 d）与层积180 d的CAT活性差异显著。

图2 不同层积处理黄连种子过氧化氢酶（CAT）活性变化

4.3 不同层积处理黄连种子超氧化物歧化酶（SOD）活性变化

由图3中可以看出，黄连种子在两种层积处理过程中，SOD 活性总体来看呈现上升趋势；随着层积时间的延长，其含量呈现坡度式的增减。方差分析结果表明，低温层积处理中对照（0 d）与层积180 d的SOD活性差异显著，常温层积处理中对照（0 d）与层积180 d的SOD活性差异不显著。

图3 不同层积处理黄连种子超氧化物歧化酶（SOD）活性变化

4.4 不同层积处理黄连种子丙二醛（MDA）含量变化

由图4中可以看出，黄连种子在两种层积处理过程中，MDA 含量总体来看呈现上升趋势；随着层积时间的延长，其含量呈现坡度式的增减；低温处理种子中MDA含量大多低于常温处理。方差分析结果表明，两种层积处理中对照（0d）与层积180d的MDA活性差异显著。

图4 不同层积处理黄连种子丙二醛（MDA）含量变化

5 讨论

过氧化物酶普遍存在于生物体内，活性较高，与植物体内多种生理活动有关。本次实验中，两种层积处理黄连种子POD 活性在层积后期显著升高，说明经过层积后，黄连种子具有较高的抗氧化酶活性，能够有效降低因自由基活性氧过多而引起膜脂质过氧化作用造成的膜损伤，保证黄连种子的活力；同时通过测定黄连种子层积过程中POD活性变化，可以了解种子休眠萌发过程中的生理代谢的活跃程度。从代谢上来看，有研究表明休眠种子的呼吸代谢以糖酵解．三羧循环(EMP-TC)途径为主，而非休眠种子则以磷酸戊糖途径(PPP)为主，要使种子打破休眠而萌发，必须使EMP-TC转为PPP途径，而POD活性的提高有利于PPP途径的进行,可能是促进休眠解除的因子之一[6]。因此，黄连种子中贮藏的富含化学能的有机物，在层积后熟的过程中释放出大量的能量，同时转变成易于吸收的形态，向种胚提供形成新组织的所需物质和能量，这些变化过程都必须要有酶的作用。黄连种子在两种层积处理后期，低温层积处理黄连种子POD活性更高，说明在此低温条件下更有利于逐步解除种子的体眠，从而促进种子萌发，这与自然状态下黄连种子的后熟特性保持一致，因此现在药农在处理黄连种子时多采用低温层积处理。

目前，人们对SOD和CAT两种酶的作用还不十分清楚，但其在呼吸作用中去除超氧阴离子自由基的作用已广为接受。植物呼吸时，线粒体的电子漏可引起呼吸链电子传递出现短路途径。如在呼吸链辅酶Q处发生电子漏，产生的超氧阴离子自由基(O2-)在线粒体SOD催化下歧化为H2O2，H2O2在CAT作用下形成H2O，便减少了O2-对植物体的危害[7-8],由此可见SOD和CAT共同作用于清除具有毒性的O2-，二者活性具有相关性。本实验测定CAT、SOD活性的变化规律也基本保持一致，证明CAT与SOD二者之间相互协同发挥清除自由基活性氧作用。且黄连种子层积处理后期随着MDA含量增加，CAT、SOD的活性也随之增强，使得体内自由基的产生和清除处于动态平衡中，维持了活性氧代谢平衡，以保证黄连种子在长达近4个月的后熟层积过程中细胞膜不受伤害以及种子发育的正常进行。

丙二醛是膜脂质过氧化的产物之一，具有细胞毒性，能与膜结构上的蛋白质和酶结合、交联而使之失去活性，从而破坏膜结构[9]。通过测定种子层积过程中MDA含量变化，可以了解种子休眠萌发过程中的种子的活力。本试验黄连种子在两种层积处理种子内部MDA含量均增加，且前期MDA缓慢增加，这表明层积初期，自由基活性氧产生较少，酶促保卫系统协同发挥作用，能有效抵御其造成的伤害。但后期随着层积时间的延长，丙二醛含量均呈现坡度式增减，说明在此过程中种子中不断产生了自由基活性氧，又不断被种子体内的抗氧化酶清除，但其调节能力有限，因而体内还是积累了过剩的氧自由基，这些氧自由基又引起膜的过氧化，产生了大量的MDA，使MDA含量上升。且在两种层积处理后期，低温层积处理黄连种子MDA的含量活性更低，说明在此低温条件下更有利于黄连种子活力的保持，这与自然状态下黄连种子的后熟特性也保持一致。

6 结论

实验证明，与恒温层积相比，变温层积黄连种子抗氧化酶活性与恒温层积有一定差异。这些现象表明变温环境下更有利于黄连种子的后熟。种子内抗氧化酶活性升高，种子内的代谢过程也被激发，为种子的萌发提供代谢准备，从而使其具有了较好的促进休眠解除的作用。因此，结合黄连种子层积中的抗氧化酶的变化规律，结合药农多年来的层积规律，该结果可以为进一步黄连种子育苗提供有力支撑。

[1] 杨淑慎,高俊凤.活性氧、自由基与植物的衰老[J]. 西北植物报,2001 (02):215.

[2] 张永峰,殷 波. 混合盐碱胁迫对苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响[J].草业学报,2009( 01):46.

[3] 段承俐,李章田,丁金玲,等. 三七种子的后熟生理特性研究[J].中国中药杂志,2010 (20):2652.

[4] 柳 鑫,黄 河,黄璐琦,吴和珍,等.黄连药材原植物资源和市场品种调查[J].中国药师, 2014 (10):1691-1695.

[5] 张春平,何 平,何俊星,等. 药用保护植物黄连种子萌发特性研究[J]. 西南大学学报(自然科学版),2008, 9:893.

[6] Robert. E H. Oxidative process and the control of germination.“Seed Ecology” [M].London butter-worth.1973, 18.

[7] 田国忠,李怀方,裘维蕃.植物过氧化物酶研究进展．武汉植物学研究,2001,19(4):332.

[8] Huff A. Peroxides-catalysed oxidation of chlorophyll by hydrogen peroxide[J]. Phytochemistry, 1982, 21:261.

[9] 李 明,王根杆.干旱胁迫对甘草幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响[J].生态学报, 2002,(04):503.

(责任编辑：李芸霞)

Study on the dynamic changes of antioxidant enzyme activity in seeds of Huanglian during after-ripening process/

LUO Tingting, MA Yun-tong, PEI Jin, ZOU Yu-xia, ZHOU Bi-qian, ZHONG Fu-rong//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To investigate the dynamic changes of antioxidant enzymes activity of Huanglian seeds during afterripening process.Method:The antioxidant enzymes activity of Huanglian were detected after strati fi cation of the seeds at 4 ± 1℃(low temperature) and 18 ± 1 ℃ (normal temperature) respectively.Result:The activities of peroxidase (POD), catalase (CAT),superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) showed increasing trend during after-ripening process. The content of peroxidase (POD) in the seeds treated at low temperature was signi fi cantly higher than that treated at normal temperature. And no signi fi cant difference of the activities of other antioxidant enzymes was found.Conclusion:Through the interaction among antioxidant enzymes, the effect of reactive oxygen on the cell structure integrity are effectively eliminated in Huanglian seeds, and the morphological and physiological maturation during after-ripening process are promoted , which ensure the seed germination.

Huanglian seeds; after-ripening; antioxidant enzymes; dynamic change

R 282.2

A

1674-926X(2017)03-001-03

中药种质资源库建设关键技术研究及示范(2014SZ0156)中药资源四川省青年科技创新研究团队(20151100028)

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室 省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

罗婷婷(1991-)，女，硕士生，从事中药品种、质量及资源研究

Email:759693714@qq.com Tel:18280131227

马云桐(1963-)，男，教授，从事中药品种、质量及资源研究

Email:mayuntong06@163.com Tel:13980598196

2016-10-08