吡唑类活性物质XY-4阳离子脂质体的包封率测定研究

穆敏婕，陈换飞， 陈 婷， 段醒妹，张梅*

·炮制制剂·

吡唑类活性物质XY-4阳离子脂质体的包封率测定研究

穆敏婕1，陈换飞1， 陈 婷1， 段醒妹2*，张梅1*

目的：研究XY-4阳离子脂质体包封率的测定方法。方法：采用薄膜法制备XY-4阳离子脂质体；用超滤离心法分离脂质体和药物，并用高效液相色谱法测定脂质体的包封率。结果：制得的脂质体包封率为84.6%；XY-4检测浓度的线性范围为20-100 μg．mL-1；平均回收率为99.8%。结论：本方法简单、准确、重现性好，可用于XY-4阳离子脂质体的包封率的测定。

XY-4阳离子脂质体；包封率；高效液相色谱法

Aurora 激酶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，包括Aurora –A、Aurora –B和Aurora –C。其中Aurora-A激酶通常位于中心体和纺锤体上，由于对于牵引分裂中的染色体向两极移动具有重要意义，常常被发现在多种肿瘤中表现出很强的活性，近年来作为抗肿瘤靶点受到人们的广泛关注。我们前期以Aurora-A激酶为靶点，计算机药物辅助设计为手段，设计并合成了一系列吡唑 [3,4-b] 吡啶类化合物，并发现了XY-4（结构如图1所示）对多种不同组织来源的肿瘤细胞如结肠癌HCT-116细胞等具有抑制细胞增殖的作用[1]。但是XY-4不溶于水，影响了后期的进一步开发研究。药物的溶解度是许多新药研发中关注的首要问题，由于难溶于水，即使其饱和溶液也难以达到有效的治疗浓度，所以改变药物的溶解度对新药的研发有着重要的意义[2]。我们将化合物XY-4制备成了一种阳离子脂质体，不仅解决了其水溶性问题，还由于阳离子脂质体的表面携带正电荷可以与带负电荷的细胞膜通过静电作用结合，更易为目标细胞摄取而发挥作用。

对于脂质体而言，包封率是评价脂质体制备和工艺的重要指标之一，也是脂质体能否发挥较普通制剂更高效、缓释等优点的关键所在，它反映了被包裹在脂质体囊泡中的药物占脂质体混悬液中药物总量的比例[3]，因此建立一种科学合理、简便易行的方法是很有必要的。

本文采用薄膜法制备出了XY-4阳离子脂质体，并参考文献[3～8]，采用超滤离心法对其包封率进行测定。该法准确性高、重现性好，为XY-4阳离子脂质体的后续体内外进一步研究提供了保障。

图1 XY-4 结构式

1 仪器与试药

高效液相色谱系统E2695及PDA检测器（美国waters公司）；EYELA-1200A型旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；JA1003型电子天平（上海顺宇恒平科学仪器有限公司）；高速离心机（赛默飞）；超滤离心管 （Millipore）

XY-4对照品及原料药（实验室自制，含量＞98%）；DOTAP（Avanti Polar Lipids, INC）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，所用超纯水均为实验室纯水系统制备（Millipore）。

2 方法与结果

2.1 XY-4阳离子脂质体的制备

采用薄膜法制备XY-4阳离子脂质体。将DOTAP和XY-4按照质量比20:1完全溶解于适量三氯甲烷中，转移到梨形瓶中，在55 ℃水浴条件下旋转蒸发1 h，除去有机溶剂，在瓶壁形成一层薄膜后于真空干燥箱中过夜。加入超纯水作为水相，55 ℃旋转水化30 min，用超纯水定容即得到一定浓度的XY-4阳离子脂质体。空白脂质体按照相同的方法制备。XY-4阳离子脂质体的平均粒径在91.3 nm（见图2）。

图2 XY-4阳离子脂质体的粒径分布图

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（75:25）；流速：1.0 mL/min；检测波长为230 nm，进样量为20 μL，柱温设置为30 ℃。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的XY-4对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀配得含XY-4 1.0 mg/mL的对照品溶液。

2.4 标准曲线的绘制

精密吸取相应体积的XY-4储备液，分别置于2 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀稀释成浓度分别为100、90、80、60、40、20 μg/mL的对照品系列溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤后取续滤液进样，按照上述色谱条件测定峰面积。以XY-4的检测浓度（C）为横坐标，以各浓度下测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=7093.9X-4606.5（r=0.9999）。结果表明，XY-4检测浓度在20-100 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取浓度分别为0.025、0.05、0.100 mg/mL 的对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件重复进样5次，测定峰面积。结果显示，峰面积的RSD值分别为1.02%。表明该仪器精密度良好。

2.6 回收率试验

精密量取浓度为1.0 mg/mL 的对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL，置于5 mL的容量瓶中，分别加入空白脂质体0.5 mL，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤后取续滤液进样，按照上述色谱条件测定峰面积。结果表明，XY-4的平均回收率为99.8%，RSD=1.24%。

2.7 包封率测定

2.7.1 样品的制备 取“2.1”项下制备的XY-4阳离子脂质体200 μL，加入2 mL甲醇溶液，超声破坏3 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤后作为工作液。按照“2.2”项下色谱条件进样测定XY-4脂质体中的XY-4总含量。

将XY-4阳离子脂质体用超滤离心管在一定转速下离心一定时间，取离心下的液体100 μL加入400 μL色谱甲醇溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，按照上述色谱条件进样测定脂质体中游离XY-4的含量。根据以下公式计算XY-4阳离子脂质体的包封率：

2.7.2 不同超滤时间对包封率测定的影响 各取同一批XY-4阳离子脂质体0.5 mL置于超滤管中，4000 rpm．min-1分别离心5 min、10 min、20 min和30 min，测定滤液中游离的药物量，计算包封率。结果见表1，离心时间在10 min之后测得的包封率基本无变化，所以超滤时间选择为10 min。

表1 不同超滤时间测得包封率结果

2.7.3 不同超滤转速对包封率的影响 各取同一批XY-4阳离子脂质体0.5 mL置于超滤管中，分别在4000、6000和8000 rpm．min-1超滤离心10 min，测定滤液中游离的药物量，计算包封率。结果见表2，转速在6000和8000 rpm．min-1时测得的包封率基本无变化，所以超滤转速选择为4000 rpm．min-1。

表2 不同超滤离心转速测得包封率结果

2.7.4 超滤膜对药物吸附性考察 精密移取XY-4对照品储备液，用色谱甲醇稀释成100、50、25 μg/mL三种浓度，各取0.5 mL于超滤离心管中，4000 rpm．min-1离心10 min，取滤液过0.45 μm微孔滤膜，按照上述色谱条件进样测定XY-4含量，计算回收率。结果见表3，可认为超滤膜对XY-4无吸附。

表3 不同浓度XY-4溶液经超滤后的回收率结果

2.7.5 XY-4阳离子脂质体包封率的测定 选取同一批制备的XY-4阳离子脂质体按照“2.7.1”项下样品处理方法处理后，采用HPLC在选定的色谱条件下测定XY-4的总含量，再用超滤离心法4000 rpm•min-1离心10min并处理后测定游离XY-4的量，计算包封率。结果测得的XY-4的平均包封率为84.6%。

3 讨论

本实验使用阳离子脂质DOTAP作为脂质层通过薄膜法制备了XY-4阳离子脂质体，得到的脂质体粒径较小，分布均匀。包封率的测定中分离脂质和游离药物的方法较多，主要包括葡聚糖凝胶法、透析法、超速离心法、离子交换树脂法等。相比较葡聚糖凝胶法的操作复杂、耗时、药物损耗较大。考虑到操作简便准确、耗时短，可有效分离游离药物和脂质体等优点，我们选择了使用超滤离心法对制备的XY-4阳离子脂质体包封率进行测定。超滤法是在离心力作用下利用筛分原理对物质进行分离。

在测定包封率之前，我们首先建立了高效液相色谱法测定XY-4含量的方法，并考察了超滤离心的时间和转速对包封率测定的影响，结果发现当转速达到4000 rpm．min-1时，离心10 min测得的XY-4阳离子脂质体的包封率基本稳定不再变化，说明在该离心条件对包封率的测定较稳定。接着我们对超滤离心管对XY-4的吸附能力进行了考察，结果表明该型号的超滤离心管对XY-4的吸附＜1%，可认为对XY-4无吸附，不影响包封率的测定。

综上所述，本实验制备出了一种粒径小且分布均匀的吡唑类活性物质XY-4阳离子脂质体，并建立了一种简便准确、操作简单易行的测定其包封率的方法，对后续深入研究具有重要意义。

[1] Shi J, Xu G, Zhu W, et al. Design and synthesis of 1,4,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-c]pyrazoles and pyrazolo[3,4-b]pyridines for Aurora-A kinase inhibitors[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2010, 20(14): 4273-8.

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(责任编辑：傅舒)

Study on the encapsulation ef fi ciency of cationic liposome of pyrazole active substance XY-4 /

MU Min-jie1, CHEN Huanfei2, CHEN Ting2, DUAN Xing-mei2, ZHANG Mei1//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, Sichuan)

Objective:To study the method of determination of the entrapment efficiency of XY-4 cationic liposome.Method:XY-4 cationic liposome was prepared by fi lm method. Liposome and drug were separated by ultra fi ltration centrifugation,and the encapsulation efficiency of liposome was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).Result:The encapsulation ef fi ciency of liposome was 84.6%. The linear range of XY-4 was 20～100 μg．mL-1. And the average recovery was 99.8%.Conclusion:The method is simple, accurate and reproducible, and can be used for the determination of the encapsulation ef fi ciency of XY-4 cationic liposomes.

XY-4 cationic liposome; entrapment ef fi ciency; HPLC

R285.5

A

1674-926X(2017)03-007-03

1成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地 成都 611137；2 四川省医学科学院•四川省人民医院 成都 610072

穆敏婕（1992-），女，在读硕士研究生

Tel:13540439524 Email:1552618356@qq.com

张梅，药物分析教授

Tel:028-61800231 Email:zhangmei63@126.com段醒妹，药剂学助理研究员

Tel:028-87393999 Email:2323272961@qq.com

2016-6-22