非小细胞肺癌组织中FOXC2和MMP-9的表达及临床意义

胡余敏 朱君飞

非小细胞肺癌组织中FOXC2和MMP-9的表达及临床意义

胡余敏 朱君飞

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中叉头框蛋白C2（FOXC2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达特点及临床意义。方法 采用免疫组化En vision二步法检测70例NSCLC及其对应癌旁组织中FOXC2、MMP-9蛋白表达情况，并分析NSCLC组织中FOXC2、MMP-9的蛋白表达与临床病理因素的关系，以及FOXC2与MMP-9蛋白表达的相关性。结果 NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白阳性表达率为71.43%、75.71%，分别高于对应癌旁组织的18.57%、15.71%（均P＜0.05）。NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白阳性表达率与临床分期、淋巴结转移有关（均P＜0.05）。NSCLC组织中FOXC2与MMP-9蛋白表达呈正相关（rs=0.674，P＜0.05）。结论 NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白表达均明显上调，其异常表达与临床分期、淋巴结转移等相关；FOXC2与MMP-9蛋白表达呈正相关。

叉头框蛋白C2 基质金属蛋白酶9 非小细胞肺癌

肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，在恶性肿瘤病死原因中居第一位[1]。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌发病总数的80%[2]。近年来，研究发现上皮-间质转化（epithelial-mesechyrnal transition，EMT）过程中上皮细胞之间的结构发生改变，细胞间连接减少，从而失去正常的极性，细胞运动能力提高，最终导致细胞表型改变[3]。叉头框蛋白C2（FOXC2）属于FOX蛋白家族成员，它是EMT中一个重要的调节子，在肿瘤进展和转移过程中常常被激活。基质金属蛋白酶9（MMP-9）在EMT过程中通过降解细胞间连接来参与肿瘤侵袭、转移的过程[4]。目前国内尚无联合探讨NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白表达特点及其临床意义的相关报道。本研究拟采用免疫组化En vision二步法检测NSCLC及其癌旁组织中FOXC2、MMP-9蛋白表达情况，分析两者表达与NSCLC临床病理因素的相关性，以初步探讨FOXC2、MMP-9表达与NSCLC进展的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2008年1月至2015年12月在临海市第一人民医院（10例）和台州市中心医院（60例）作手术切除的NSCLC标本，所有患者临床资料完整，均经病理学检查明确诊断，术前均未接受过放、化疗。70例NSCLC患者中，男 42 例，女 28 例；年龄 48（30，80）岁；＜60 岁25例，≥60岁45例。参照2004年WHO肺肿瘤组织学分类标准：鳞癌30例，腺癌40例；高分化24例，中低分化46例。依据2010年国际抗癌联盟（UICC）肺癌TNM分期标准：Ⅰ期21例，Ⅱ期23例，Ⅲ期26例。淋巴结转移：有31例，无39例。同时另取同期距离肿块边缘5cm外的对应癌旁正常组织作为对照。

1.2 主要试剂 FOXC2兔抗人多克隆抗体（ab65141）购自英国Abcam公司；MMP-9兔抗人单克隆抗体（ab76003）购自福州迈新生物技术有限公司；免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 实验步骤 所用标本采用10%的中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、染色。取石蜡组织常规连续切片，厚约4μm；采用免疫组化En vision二步法，按照试剂盒说明书进行操作。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织作阳性对照。

1.4 结果判定 FOXC2、MMP-9表达均定位于细胞质，呈现淡黄色或棕黄色颗粒分布即为阳性细胞。在光学显微镜下，观察＞5个高倍视野、计数≥1 000个细胞中的阳性细胞数。若阳性细胞数≥10%为阳性，＜10%为阴性。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。计量资料用 M（P25，P75）表示；计数资料用率比较，组间比较采用χ2检验；采用Spearman等级相关分析NSCLC组织中FOXC2与MMP-9蛋白表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC和癌旁正常组织中FOXC2、MMP-9蛋白表达的比较 FOXC2、MMP-9在细胞质中的阳性表达，见图1。NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白阳性表达率分别为 71.43%（50/70）和 75.71%（53/70），分别高于对应癌旁组织中的 18.57%（13/70） 和 15.71%（11/70），差异均有统计学意义（χ2=39.509、50.773，均P＜0.05）。

图 1 NSCLC 组织中 FOXC2、MMP-9蛋白表达（a：FOXC2；b：MMP-9；En vision 二步法，×400）

2.2 NSCLC组织中FOXC2、MMP-9的蛋白表达与临床病理因素的关系 随着NSCLC患者临床分期进展、淋巴结转移的发生，FOXC2、MMP-9蛋白阳性表达率均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白阳性表达率在不同年龄、性别、组织学类型、分化程度的患者间比较，差异均无统计学意义（均PP＞0.05），见表1。

表1FOXC2和MMP-9表达与NSCLC临床病理因素的关系[例（%）]

2.3 NSCLC组织中FOXC2与MMP-9蛋白表达的相关性 70例NSCLC标本中，FOXC2和MMP-9表达共阳性47例，共阴性14例；FOXC2与MMP-9蛋白表达呈正相关（rs=0.674，P＜0.05），见表 2。

表2 NSCLC组织中FOXC2和MMP-9表达的相关性（例）

3 讨论

FOX是一个拥有相似的DNA结合域的蛋白家族，对DNA的转录起着至关重要的作用。FOX2属于FOX转录因子超家族成员之一，最早发现在大鼠脑组织有表达。FOXC2基因定位于人类染色体16q24，由一个编码的外显子构成，其编码的蛋白参与EMT的生物学过程，EMT在肿瘤演进过程中由肿瘤细胞获得[5]。近年来研究表明，FOXC2在大肠癌、鼻咽癌及食管癌等恶性肿瘤中表达上调，其异常表达与肿瘤的浸润和转移密切相关[6-8]。Li等[9]报道FOXC2过表达与大肠癌的预后不良有关；进一步作体外实验，通过短发夹RNA敲除FOXC2表达能明显抑制大肠癌细胞的侵袭和转移能力。本研究中70例NSCLC组织中FOXC2蛋白阳性表达率为71.43%，明显高于正常癌旁组织的18.57%；这表明FOXC2过表达与NSCLC的发生有关。本研究还发现，随着临床分期进展及淋巴结转移的发生，FOXC2蛋白阳性表达率明显升高；这表明FOXC2蛋白表达与临床分期及淋巴结转移密切相关。有学者发现，FOXC2可通过促进血管和淋巴管的生成或诱导肿瘤细胞发生EMT-MET转化，从而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[10]。

MMPs是一组锌离子具有跨膜转运及分泌功能的中性肽链内肽酶，可降解基底膜和细胞外基质的多种蛋白质、激活细胞因子、参与新生血管调节等，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究表明，基底膜和细胞外基质的降解是肿瘤侵袭和转移发生的重要原因，MMPs家族通过对细胞外基质的降解，参与肿瘤侵袭和转移过程，从而导致肿瘤的恶性进展和远处转移[11]。MMP-9是其家族中的主要成员，近年来研究发现MMP-9在多种恶性肿瘤中出现过表达，且与肿瘤的侵袭性相关[12-13]。本实验结果表明，NSCLC组织中MMP-9蛋白阳性表达率为75.71%，明显高于正常癌旁组织的15.71%，且MMP-9表达与患者临床分期及淋巴结转移有关。以上说明MMP-9表达升高参与NSCLC发生、转移过程，患者临床分期高，预后差。Nishida等[8]对食管癌组织中FOXC2 mRNA和蛋白水平检测发现，食管癌组织中FOXC2高表达的患者，MMP2、MMP-9蛋白表达亦明显升高，从而降解基底膜和细胞外基质，促进肿瘤的局部浸润和远处转移，导致恶性肿瘤患者预后差。本研究分析NSCLC组织中FOXC2与MMP-9的蛋白表达的相关性，发现两者存在正相关，是一对协同作用的因素；FOXC2通过上调MMP-9蛋白表达促进NSCLC的发生、发展。

综上所述，NSCLC组织中FOXC2、MMP-9蛋白高表达患者易发生转移，预后不良；FOXC2与MMP-9的蛋白表达存在正相关。因此，联合检测NSCLC组织中FOXC2与MMP-9蛋白表达水平有利于评估肿瘤的转移能力和预后。NSCLC组织中过表达的FOXC2如何通过信号通路上调MMP-9蛋白表达的作用机制需进一步研究。

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Expression of FOXC2 and MMP-9 in non-small cell lung cancer and its clinical significance

HU Yumin,ZHU Junfei.Department

of Respiratory Medicine,the First People's Hospital of Linhai,Linhai 317000,China

Objective To investigate the expression of Forkhead C2(FOXC2)and matrix metallo proteinase 9(MMP-9)in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its clinical significance. Methods The expression of FOXC2 and MMP9 was detected in 70 cases of NSCLC and non-cancerous adjacent tissues by immunohistochemical En Vision method. Results The positive rates of FOXC2 and MMP-9 were significantly higher in cancer tissue than those in non-cancerous adjacent tissues(P＜0.05).The expression of FOXC2 and MMP-9 protein was correlated with clinical stage and lymph node metastasis(P＜0.05).There was a positive correlation between FOXC2 and MMP-9 expression in NSCLC(P＜0.05). Conclusion The expression of FOXC2 and MMP-9 is significantly increased in NSCLC,which is closely correlated with occurrence and malignant development of NSCLC.

FOXC2 MMP-9 Non-smallcelllung cancer

2016-07-18）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2017-384

317000 临海市第一人民医院呼吸内科（胡余敏）；台州市中心医院呼吸内科（朱君飞）

胡余敏，E-mail：chenrx2014@126..com