急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型的表达变化及临床意义

王斌达 叶指南 唐维国 刘春艳 周琳 续力云

急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型的表达变化及临床意义

王斌达 叶指南 唐维国 刘春艳 周琳 续力云

目的 探讨急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型的表达及其临床意义。方法 选择发病＜24h入院的36例急性脑梗死患者为脑梗死组、同期在神经内科治疗的32例头晕患者为对照组，检测脑梗死组患者入院当天及第2、5、7～10天以及随访第90天，对照组入院当天的血清单核细胞计数、单核细胞各亚型百分比，分析单核细胞亚型与病情的关系。 结果 与对照组相比，脑梗死组经典型单核细胞百分比各时间点均无明显变化（均PP＞0.05）；中间型单核细胞百分比入院当天及第2、5、7～10天均明显升高（均P＜0.05）；非经典型单核细胞百分比入院第2、5天均明显下降（均P＜0.05）。脑梗死组入院当天单核细胞计数与NIHSS评分呈正相关（r=0.508，P＜0.05）；3个亚型百分比与NIHSS评分均未见相关（均PP＞0.05）。与未感染者比较，脑梗死感染患者入院第2、5、7～10天单核细胞计数均明显升高（均P＜0.05），非经典型单核细胞百分比均明显下降（均P＜0.05）；中间型单核细胞百分比入院当天及第2、5天均明显升高（均P＜0.05）；经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义（均PP＞0.05）。与预后良好组比较，脑梗死预后不良组入院第2、5天单核细胞计数、中间型单核细胞百分比均明显升高（均P＜0.05），非经典型单核细胞百分比均明显下降（均P＜0.05）；经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义（均P＜0.05）。 结论 急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型变化有一定的规律，中间型单核细胞、非经典型单核细胞可能与脑梗死相关感染及预后有关。

单核细胞 CD14 CD16 脑梗死

炎症反应参与脑梗死的缺血损伤，与脑梗死的发生、发展及预后密切相关[1-3]。单核细胞是重要的炎症反应细胞，在急性脑梗死人群中观察到单核细胞上高表达的人类白细胞抗原DR位点抗原表达减少，其分泌的TNF-α减少，这表明单核细胞活性下降，可能与脑梗死早期阶段免疫抑制有关[4]。目前，人类单核细胞亚型的划分主要基于脂多糖受体CD14和IgG Fc段受体CD16的表达水平[5-6]。在正常人群中，循环血中80%～90%的单核细胞表达CD14++CD16-（经典型单核细胞），约10%的单核细胞表达CD14+CD16++（非经典型单核细胞）和CD14++CD16+（中间型单核细胞）[5,7]。单核细胞亚型在脑梗死的病理、生理过程中也许具有特定的作用，若其作用机制能被准确阐明，它们有可能成为有效的治疗靶点。本文就急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型的表达变化及临床意义作一探讨，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择舟山医院2014年2月至2015年4月收治的36例急性脑梗死患者（发病＜24h入院）为研究对象，其中男 20 例，女 16 例；年龄 42～79（69.1±10.1）岁。入组标准：年龄＜80岁；发病时间＜24h；病前改良Rankin量表（mRS）评分≤2分；病后美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分≥3分；符合2014年中国急性脑梗死诊治指南的诊断标准，均经头颅CT或MRI诊断。排除标准：入院时有发热、感染等症状（体温＞37.8℃，WBC＞11×109个/L 或＜4×109个/L）；入院前 3个月曾使用过抗生素、免疫抑制剂、类固醇激素；入院前3个月有脑出血、脑脓肿、短暂性脑缺血发作、颅内手术及外伤史；既往有血液病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、肝炎、结核病史；准备行溶栓者。选择同期在舟山医院神经内科治疗的32例头晕患者进行对照，其中男17例，女15例；年龄49～74（68.7±7.8）岁；均经头颅CT或MRI排除急性卒中。两组患者年龄、性别、吸烟、合并基础疾病等情况比较，差异均无统计学意义（均PP＞0.05），见表 1。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 试剂和仪器 FITC标记的单克隆抗体CD14（20μl/支，Cat NO.557153）、PEcy5 标记的单克隆抗体CD16（20μl/支，Cat NO.561313）、阴性对照 IgG（0.1mg,Cat NO.556651；0.1mg，Cat NO.556652） 和 FACS lysis solution（100ml，Cat NO.349202） 均由美国 BD 公司提供；血液自动分析仪为日本希森美抗公司生产的Sysmex XE-2100型，试剂为该公司供给的配套试剂盒；流式细胞仪为美国BD FACSCalibur。

1.3 方法

1.3.1 血清检测 脑梗死组患者入院当天（用药前）及第 2、5、7～10 天的 6∶30～8∶00，随访第 90 天分别采集静脉血，并在30min内分离血浆，并保存在-80℃冰箱内。对照组患者于入院当天采集静脉血。（1）外周血单核细胞计数的测定：采集静脉血3ml，加入EDTA抗凝管中，由舟山医院血常规室采用日本希森美抗公司Sysmex XE-2100型血液自动分析仪作统一检测。（2）单核细胞CD14、CD16的测定：①取2支流式细胞仪管，均加入已分离出血浆的抗凝血细胞80μl；在试管1加入阴性对照IgG，在试管2中加入FITC标记的CD14、PEcy5标记的CD16各4μl；震荡混匀，保存在4℃暗箱中30min。②加入2ml红细胞溶解液，震荡混匀，静置于37℃温水浴中10min中，2 500r/min离心5min，弃上清液，残留物中加200μl PBS，立即上机检测。

1.3.2 评价标准 入院7d内，每天记录NIHSS评分；随访期间脑梗死后第90天，记录NIHSS评分、mRS评分。（1）预后良好：脑梗死后第90天NIHSS评分0或1分，且mRS评分≤2分。（2）感染：依据国家卫生部关于医院感染的诊断标准[8]。①下呼吸道感染：患者出现

咳嗽、痰黏稠、肺部出现啰音并伴随下列三项中一项（发热、WBC或中性粒细胞比例增高、X线示有肺部炎症浸润性病变）。②尿路感染：患者出现尿路刺激征，或有下腹触痛、肾区叩痛伴或不伴发热并具有下列情况之一（尿检白细胞：男性≥5个/高倍视野，女性≥10个/高倍视野；插导尿管患者结合尿培养）；临床已诊断为泌尿道感染，或抗菌治疗有效而认定的泌尿道感染。

1.4 统计学处理 应用SPSS 21.0统计软件。计量资料符合正态分布，用表示，组别比较采用独立样本t检验；组内各时点比较采用方差分析。脑梗死组入院当天单核细胞计数及其亚型与NIHSS评分的关系采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死组基本情况 住院1周内，脑梗死组发生感染9例，占25.0%；包括肺炎8例、泌尿系感染1例。住院期间病死3例；随访期间病死3例，失访4例。

2.2 脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化及与对照组比较 脑梗死组入院当天及第2、5天单核细胞计数逐渐增高，之后逐渐恢复；入院当天及第2、5、7～10天与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。脑梗死组入院当天及第 2、5、7～10天经典型单核细胞百分比与对照组比较，差异均无统计学意义（均PP＞0.05）。脑梗死组入院当天及第2、5天中间型单核细胞百分比逐渐增高，第7～10天逐渐恢复；入院当天及第2、5、7～10天与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。脑梗死组入院当天及第2、5天非经典型单核细胞百分比逐渐下降，第5天达最低值，之后逐渐恢复；入院第2、5天与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化及与对照组比较

2.3 脑梗死患者入院当天单核细胞计数及其亚型与NIHSS评分的关系 脑梗死组入院当天单核细胞计数与NIHSS评分呈正相关（r=0.508，P=0.002），单核细胞3个亚型百分比与NIHSS评分均无明显相关性（经典型：r=0.231，P=0.174；中间型：r=0.084，P=0.627；非经典型：r=-0.205，P=0.2297），见图 1。

2.4 感染与未感染脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化与比较 与未感染者比较，脑梗死感染患者入院第2、5、7～10天单核细胞计数均明显升高，非经典型单核细胞百分比均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；中间型单核细胞百分比入院当天及第2、5天均明显升高（均P＜0.05）；经典型单核细胞百分比各时点比较差异均无统计学意义（均PP＞0.05），见表3。

2.5 预后不良与良好脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化与比较 与预后良好组比较，脑梗死预后不良组入院第2、5天单核细胞计数、中间型单核细胞百分比均明显升高，非经典型单核细胞百分比均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；经典型单核细胞百分比各时间点比较差异均无统计学意义（均P＜0.05），见表 4。

3 讨论

本研究发现，脑梗死早期单核细胞计数增高，而后逐渐下降，提示脑梗死后单核细胞处于激活状态，可能与病后下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴和交感神经系统激活、刺激骨髓池中幼稚的单核细胞释放入外周血有关[9]。有研究表明经典型单核细胞处于相对低分化的幼稚阶段，占外周血单核细胞总数的80%～90%；当机体在炎症免疫反应的刺激下，开始表达CD16并伴有CD14表达下调，逐渐转化为中间型单核细胞，最后成熟后呈现CD16高表达、CD14低表达的状态，即非经典型单核细胞[10]。本研究中脑梗死患者经典型单核细胞变化不大，可能因为幼稚的经典型单核细胞储备大，占全部单核细胞的大部分，致使少量的经典型单核细胞成熟转化后在总体上观察经典型单核细胞仍无明显变化。此外，中间型单核细胞总的趋势表现为先增高再逐渐恢复的动态变化过程，提示机体在炎症免疫刺激下会使单核细胞逐渐分化成熟。而更为成熟的非经典型单核细胞在脑梗死急性期反而下降，原因可能是与其他亚型相比，非经典型单核细胞有更高的迁徙能力，急性应激状态下能迅速从血管迁徙到损伤组织，导致外周血中非经典型单核细胞不升反而下降[11-12]。

图1 脑梗死患者入院当天单核细胞计数及其亚型与NIHSS评分的散点图

表3 感染与未感染脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化与比较

表4 脑预后不良与良好脑梗死患者入院后不同时点单核细胞计数及其亚型的变化与比较

研究表明中间型单核细胞具有强大的吞噬活性及抗原提呈作用[13]。在类风湿性关节炎、冠状动脉粥样硬化性心脏病等多种慢性炎性疾病进展期，中间型单核细胞明显升高，且与疾病的进展、预后相关[14-16]。本研究发现脑梗死急性期中间型单核细胞逐渐升高，可能与急性应激状态下经典型单核细胞逐渐转化为中间型单核细胞有关。此外，预后不良的脑梗死患者中间型单核细胞升高更为明显，可能由于急性发病时本身病情重，脑组织损伤范围广泛，从而导致中间型单核细胞反应性升高。中间型单核细胞的升高，进一步加重了机体的炎症免疫反应，增强了单核细胞对损伤脑组织及细胞的清除，造成缺血脑组织的二次损伤。Deng等[17]研究发现中间型单核细胞可促进诱导型一氧化氮合酶的表达，再次对神经组织造成毒性损害。因此，寻求阻断经典型单核细胞向中间型单核细胞转化的有效方法，可能为脑梗死的治疗提供新方向。Kaito等[5]研究发现非经典型单核细胞较其他亚型具有更高的迁移能力，在脑梗死早期就能迅速迁移到损伤的炎性组织周围。本研究显示入院后出现感染的脑梗死患者非经典型单核细胞明显减少，可能由于脑梗死后大量的非经典型单核细胞迅速从血管中迁徙到损伤组织，导致机体免疫防御功能下降，从而使脑梗死患者更容易发生感染。Auffray等[12]利用感染的大鼠作为模型，发现与人类非经典型单核细胞同源的大鼠Ly6Clow非经典型单核细胞能在感染的数小时内迅速从血管中迁移到感染组织中。本研究发现感染的脑梗死患者非经典型单核细胞进一步下降，可能由于非经典型单核细胞大量迁移到感染组织所致。

综上所述，急性脑梗死患者单核细胞CD14+CD16+亚型变化有一定的规律，中间型单核细胞、非经典型单核细胞可能与脑梗死相关感染及预后有关。建议进一步研究脑梗死后单核细胞及其亚型的分子机制，可能为脑梗死病情预测及治疗提供新策略。

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Changes of monocyte CD14+CD16+subtypes in patients with acute cerebral infarction and its clinical significance

WANG Binda,YE

Zhinan,TANG Weiguo,et al.Department of Neurology,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

Objective To investigate the changesof CD14+CD16+monocytes in patients with acute cerebral infarction and clinical significance. Methods Thirty six patients with acute cerebral infarction admitted within 24 h of onset(study group)and 32 patients with dizziness hospitalizedat the same period(control group)were enrolled in the study.The peripheral monocyte count and the percentage of monocyte subtype in study groupwere determined at 0,2,5,7-10d after admission and 90d in the followed up;those were measure at admission in control group.The correlation between monocyte subtypes and the progression of acute cerebral infarction was analyzed. Results Compared with the control group,the percentage of typical monocytes(CD14++CD16-)showed no significant changes at all time points in cerebral infarction group(PP＞0.05).The percentage of intermediate monocytes(CD14++CD16+)was significantly increased at d0,d2,d5,d7 and d10 after admission(P＜0.05),the percentage of non-typical monocytes(CD14+CD16++)was significantly decreased at d2 and d5(P＜0.05).There was a positive correlation between monocyte count and NIHSS score (r=0.508,P＜0.05)at admission,while no correlation between the subtypes of monocytes and NIHSS scores(PP＞0.05).Compared with non-infected patients,the monocyte count in infected cerebral infarction patients was significantly increased(P＜0.05),the percentage of non-typical monocytes was significantly decreased(P＜0.05),the intermediate monocytes were significantly increased(P＜0.05)at d0,d2 and d5 of admission,while the typical monocytes showed no significant differences at all time points(P＜0.05).Compared with the petients with good prognosis,the monocyte count and the percentage of intermediate monocytes were significantly increased at d2 and d5 in patients with poor prognosis(P＜0.05),and the percentage of non-typical monocytes was significantly decreased(P＜0.05),but the percentage of typical monocytes showedno significant difference at all time points(PP＞0.05). Conclusion The CD14+CD16+monocytes change with the progression of the disease in patients with acute cerebral infarction.The changes of intermediate monocytes and non-typical monocytes may be related to the infection and prognosis of cerebral infarction.

Monocytes CD14 CD16 Cerebral infarction

2016-07-09）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-1047

舟山市科技局项目（2014C31067）

316021 舟山医院神经内科（王斌达、周琳、刘春艳、唐维国），细胞分子生物实验室（续力云）；台州市立医院神经内科（叶指南）

续力云，E-mail：xuliyunhappy@126.com