零售鸡肉中沙门氏菌生长预测模型的建立

孙婷婷 ，赵 格 ，宋 雪 ，赵建梅 ，刘 娜 ，王 娟 ，李月华 ，黄秀梅 ，王君玮 ，邹 明

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.农业部畜禽产品质量安全风险评估试验室（青岛），山东青岛 266032；3.青岛农业大学，山东青岛 266109）

零售鸡肉中沙门氏菌生长预测模型的建立

孙婷婷3，赵 格1，2，宋 雪1，赵建梅1，2，刘 娜1，2，王 娟1，2，李月华1，2，黄秀梅1，2，王君玮1，2，邹 明3

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.农业部畜禽产品质量安全风险评估试验室（青岛），山东青岛 266032；3.青岛农业大学，山东青岛 266109）

为了建立零售鸡肉中沙门氏菌的生长预测模型，以在超市购买的新鲜鸡肉和肠炎沙门氏菌作为研究对象，选择4、10、16、25、30、37 ℃条件，对肠炎沙门氏菌在零售鸡肉中的生长情况进行研究，绘制生长曲线。对一级模型，用CurveExpert软件中的Gompertz、Richards、Logistic 3种模型和DMFit软件中的Baranyi模型进行拟合，以确定最适用模型。4种模型拟合后的Baranyi模型相关系数都在0.98以上。数据表明该模型拟合程度最好，最适合预测沙门氏菌在鸡肉中的生长动态。二级模型是将一级模型拟合的数据带入Ratkowsky方程。此方程描述的是温度对最大生长速率的影响。通过准确因子、偏差因子以及均方根误差，对模型的准确性进行检验。结果显示模型的准确因子为1.129 698，偏差因子为0.984 85，均方根误差为0.091 5，决定系数R2为0.982 5，说明建立的模型可靠性高。

沙门氏菌；零售鸡肉；预测微生物学；生长模型

在各类食源性疾病中，由病原微生物引起的占很大比例[1]。据统计，2014年我国由微生物引起的中毒事件例数和人数分别占食物中毒总例数和总人数的42.5%和67.7%，比2013年升高了5.3%和1.8%，死亡率也升高了0.9%。沙门氏菌是引起食物中毒的主要致病菌，占40.0%～60.0%[2]。沙门氏菌污染率在鲜肉及肉制品中最高。对北京、上海、四川等8个省份调查发现，零售鸡肉中沙门氏菌污染率平均高达52.2%[3]。这可能是在肉鸡的屠宰、加工、运输、贮藏过程中，由于某些措施不当污染了沙门氏菌，并使其在适宜的环境条件下大量繁殖。

近年来，我国的鸡肉消费需求量日益增加。联合国粮食及农业组织（FAO）2013年的统计结果显示，我国鸡肉年产量1 279万吨，占总禽肉量的70.0%。肉鸡在进入加工厂时，其沙门氏菌携带率并不高，但经过一系列加工操作后，由于交叉污染等因素，在出加工厂时，沙门氏菌携带率非常高[4]，从而导致市面上零售的鸡肉中沙门氏菌检出率特别高。FAO于2002年对沙门氏菌实际暴发的统计显示，人们摄入含有沙门氏菌量达到105cfu的食物，就可以发生食物中毒[5]。因此，研究沙门氏菌在鸡肉中的生长动态，快速预测沙门氏菌在鸡肉中的生长、存活和死亡规律，可为消费者在消费、储存和食用鸡肉过程中做正确指导，从而更好地保证食品安全。

预测微生物学（Predictive microbiology）是对微生物随着外界环境的改变和不同可能出现的变化进行预测，主要应用于食品中微生物动态的研究。Ding[6]、Whiting[7]和FERRER[8]将微生物预测模型分为三级：一级模型描述不同环境条件下，微生物浓度随时间的变化关系；二级模型描述经一级模型拟合曲线后得到的参数与环境变量之间的关系；三级模型是将一二级模型结合起来建立的计算机程序软件，可以用来预测一定条件下的微生物变化情况。可见研究一级和二级模型是最基础，也是最主要的。预测微生物学可为微生物风险评估提供不同环境下的微生物生长数据，是食品中微生物风险评估（Microbiological risk assessment，MRA） 的 重要手段。一直以来，各国学者通过不同软件和模型，对食品中沙门氏菌等致病菌的预测微生物学模型进行拟合分析，并通过验证来确定最优生长预测模型。美国食品药品监督管理局（FDA）早在1998年就对带壳鸡蛋和蛋制品中的肠炎沙门氏菌进行了风险评估，首次将沙门氏菌的预测微生物学研究引入动物产品的风险评估。欧洲食品安全局于2010年发布了生猪饲养和屠宰过程中以及禽蛋中的沙门氏菌定量风险评估报告，其中也应用了沙门氏菌生长动力学模型。由于不同地域分离的沙门氏菌基因型和表型都存在差异，而且不同地域的动物产品品质和温湿度微环境也有所不同，所以构建本土沙门氏菌的预测微生物学模型，对更准确地风险评估研究非常重要。

本试验以零售鸡肉为材料，通过预测微生物学软件CurveExpert和DMFit中的不同模型，对不同温度下沙门氏菌在鸡肉中的生长动态进行曲线拟合，建立不同温度下的沙门氏菌的生长预测模型，为鸡肉生产和消费作科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株。肠炎沙门标准菌株，购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 试验样品。购自零售终端的新鲜鸡胸脯肉。

1.1.3 培养基。沙门氏菌显色培养基，购自郑州博赛生物技术股份有限公司；无菌匀质袋等耗材，购自北京路桥技术股份有限责任公司。

1.1.4 仪器与设备。生化培养箱，购自上海新苗医疗器械制造有限公司；拍击式匀质器，购自法国Interscienc公司；生物安全柜，购自上海力申科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅，购自上海申安医疗器械厂；电子天平，购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 悬菌液的制备。将沙门氏菌平板划线培养

18 h，挑取单个菌落于营养肉汤中，置于摇床中，37 ℃、180转培养3 h，测定菌液浓度（约107～108cfu/mL），再将菌液用生理盐水稀释成浓度为103cfu/mL的悬菌液，备用。

1.2.2 供试鸡肉的制备。将新鲜鸡胸脯肉平铺于无菌操作台中，用紫外线照射15 min后，翻动另一面再照射15 min。再将鸡肉浸入80 ℃无菌水中处理20 s，取出后无菌取鸡胸脯肉内部肉，切成1 g左右的肉丁备用。

1.2.3 鸡肉接种、培养、计数。将鸡肉放入制备好的悬菌液中浸泡30 s，取出后沥去多余水分，使鸡肉的细菌接种量为102cfu/g，将其分装于匀质袋中（鸡肉从购买到处理完时间不超过2 h），分别置于4、10、16、25、30 、37 ℃中培养。其中4、10 ℃每24 h取1次样，16 ℃每12 h取1次样，25 ℃每4 h取1次样，30、37 ℃每2 h取1次样。每个温度下设3组平行试验；每组平行试验在每次取样点设3个重复样品。每次取10 g肉于匀质袋中，加入90 mL无菌生理盐水，用拍击式匀质器匀质5 min；经适当的倍比稀释后，用平板计数法进行细菌计数。

1.2.4 一级模型的建立。将试验取得的数据，用Curve Expert1.4软 件 中 的 Gompertz、Richards、Logistic 3种模型和DMFit软件中的Baranyi 模型进行拟合，通过4种模型相关系数的比较，选择出最适用的模型。4种模型的方程表达式如下：

（注：a、b、c、d为模型拟合后的系数；Nt为时间为t时的细菌数；N0为初始染菌数）

（注：t为任意时刻；Nt为时间为t时的细菌数；N0为初始染菌数；µm为最大生长速率；λ为迟滞期；A（t）和细胞的生理状态及环境适应性有关）

1.2.5 二级模型的建立。根据Ratkowsky提出的经典的平方根方程[9-10]建立二级模型。二级模型描述的是沙门氏菌生长速率与温度之间的关系。

（注：√µm为生长速率；a为斜率；tmin为当沙门氏菌生长速率为零时的温度）

1.2.6 模型检验。本试验采用准确因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Biasfactor，Bf）及均方根误差（RMSE）来检验得到的模型。

2 结果与分析

2.1 一级模型的建立

在本试验中，鸡肉中的沙门氏菌在4 ℃条件下10 d后，测得菌量与初始菌量相比，无明显变化。这说明沙门氏菌在4 ℃条件下没有生长，无法拟合曲线。所以只对10、16、25、30、37 ℃ 5个温度条件下沙门氏菌的生长动态进行了曲线拟合，根据其相关系数选择最适模型。相关系数R可以衡量预测值与试验观测值的相关程度。R值越接近1，表示模型的参考价值越高。各种模型拟合得到的相关系数见表1。

表1 各模型拟合曲线的相关系数（R）

由表1可以看出，各个模型拟合的曲线相关系数都在0.90以上，拟合性较好。其中Baranyi 模型和Richards模型对各个温度下拟合的曲线的相关系数都比较高，都在0.99以上，以Baranyi模型拟合性最好。因此，Baranyi 模型是最适宜描述沙门氏菌在鸡肉中生长动态的生长模型。其拟合参数见表2，拟合图见图1。根据Baranyi模型拟合的数据建立二级模型。

表2 Baranyi 模型拟合的参数

图1 Baranyi 模型拟合的沙门氏菌在不同温度下的生长曲线

2.2 二级模型的建立

将Baranyi 模型拟合的不同温度下的最大比生长速率µm值带入Ratkowsky方程，进行拟合，得描述沙门氏菌生长速率与温度关系的二级模型（图2）。模型表达方程式为：√µm=0.028 9t-0.051 6，决定系数R2为0.982 5。

2.3 模型检验

对得到的二级模型方程，用准确因子（Af）、偏差因子（Bf）及均方根误差（RMSE）来检验，结果见表3。Af越接近1，表示预测值与实测值的相对标准偏差越小，实测值与预测值的吻合性越高。Bf表示预测值高于或者低于实测值的程度，也是越接近1，表示实测值与预测值越接近，大于1表示实测值比预测值大，小于1表示实测值比预测值小。RMSE值越小，说明预测值与实测值越接近。

图2 最大比生长速率与温度关系的二级模型拟合曲线

表3 模型验证结果

3 讨论

目前，我国对鲜鸡肉中沙门氏菌预测生长模型的研究较少。大部分都是对鲜鸡肉中沙门氏菌污染情况及鲜鸡肉中沙门氏菌定量的研究[11-13]。仅赵瑞兰[4]对进出口分割鸡肉中沙门氏菌预测微生物生长模型进行过研究。其采用冷冻后的鸡肉进行试验，对数据用CurveExpect软件中的Gompertz、Richards、Logistic、MMF模型进行拟合，制作沙门氏菌生长曲线。但其只建立了一级模型，没有建立二级模型。而本试验取更能代表我国居民日常鸡肉膳食的市场零售新鲜鸡肉，接种标准肠炎沙门氏菌，根据生产、储存新鲜鸡肉的习惯，合理设置温度条件，分别在4、10、16、25、30、37 ℃下进行培养，定时进行细菌计数，利用预测微生物学软件进行拟合分析。

本研究分别用Curve Expert 1.4软件中的Gompertz、Richards、Logistic模型和 DMFit软件中的Baranyi 模型对所得数据进行拟合，选择出最优模型即Baranyi 模型，进行二级模型的建立。Baranyi 模型拟合的各个温度下的曲线，相关系数都在0.980 0以上。这表明Baranyi 模型能更好地描述沙门氏菌在鸡肉中的生长情况。二级模型建立用的是经典的平方根方程，即Ratkowsky方程。经拟合后，方程决定系数为0.982 5，拟合度高。经检验，其准确因子（Af）为1.129 698，接近于1，偏差因子（Bf）为0.984 850，接近于1，均方根误差（RMSE）值非常小为0.091 500。这些数据说明U预测值与U实测值相差不大，方程的可靠性高。Baranyi 模型是沙门氏菌在食品预测生长动力学研究中用的越来越多的模型，在鲜切蔬菜、草鱼鱼糜、鲜猪肉中均有应用。它相比较于其它模型，能计算出迟滞期、最大生长速率等参数，充分考虑了微生物生长的特殊性以及基质与微环境的差异性，比其它模型更完善，拟合度更高。近年来，国外在鸡肉、鸡蛋和牛肉中的沙门氏菌预测微生物学研究也多采用Baranyi模型[15-16]。但是由于菌株特异性以及基质与微环境的不同，模型中获得的每个温度下的最大比速率常数与本研究都有所差异，带入我们的实际数据计算，更是有较大差异。应该说国外研究的模型并不适于直接应用到我国本土的风险评估中，所以需要继续加强适于我国本土的食源性致病微生物风险评估的预测微生物学模型研究。

本试验在样品处理方面将鸡肉处理成肉丁，浸入制备的细菌悬液中，充分保证了接菌量均匀。为保证试验的可重复性，排除其它未知因素的影响，试验前期做了大量预试验，分别从不同超市及农贸市场购买鸡肉做重复试验，发现从不同超市和农贸市场采集的新鲜鸡肉试验后的数据相差不大。虽然如此，但本试采取的是验建立的模型，还有很多不确定性。本试验无菌取鸡肉，而生活中购买的鸡肉可能有许多其它微生物。各种微生物的生长繁殖，可能影响沙门氏菌的生长[14]。试验表明，沙门氏菌4 ℃下的在鸡肉中基本是不生长的。

本试验所建立的模型，虽然不能用于精确计算，但在科学研究中，可为食品的风险评估工作提供依据；在生活中，可以指导鲜鸡肉的安全生产、储藏、运输及百姓的安全消费和存储；对保障食品安全、规避风险、防控疾病中，具有极其重要的意义。

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（责任编辑：杜宪）

Establishment of Growth Prediction Model for Salmonella in Retail Chicken

Sun Tingting3，Zhao Ge1，2，Song Xue1，Zhao Jianmei1，2，Liu Na1，2，Wang Juan1，2，Li Yuehua1，2，Huang Xiumei1，2，Wang Junwei1，2，Zou Ming3
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Livestock and Poultry Products Quality and Safety Risky Risk Assessment Laboratory，Ministry of Agriculture（Qingdao），Qingdao，Shandong 266032；3. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

To establish the growth prediction model for Salmonella in retail chicken，Salmonella enteritis in fresh chicken sampled from supermarket at different temperature were studied. The growth of Salmonella enteritidis in retail chicken was studied at 4，10，16，25，30 and 37 ℃，and the growth curve was drawn. The first grade model was fitted with 3 models，including Gompertz，Richards and Logistic in CurveExpert software and Baranyi model in DMFit software，and the most suitable model was determined. After fitted by four models，Baranyi model showed the best fitting with all the correlation coefficients at different temperature above 0.98，which was the most suitable for predicting the growth dynamics of Salmonella in chicken. The second level model，which described the effect of temperature on the maximum growth rate，was predicted by putting the fitting data obtained from the first level into Ratkowsky equation. The accuracy of the model was tested by the accuracy factor，the bias factor and the root mean square error. Results showed that the accuracy factor of this second growth model was 1.129 698，the bias factor was 0.984 85. the root mean square error was 0.091 5，and the coefficient of determination was 0.982 5. The results showed that the reliability of the established model was high.

Salmonella；retail chicken；predictive microbiology；growth model

S852.61

A

1005-944X（2017）11-0017-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.005

国家农产品质量安全风险评估项目计划（GJFP201600703、GJFP201700703）；科技部科技基础性工作专项（2012FY111000）