肾综颗粒对肾病综合征大鼠微炎症的影响

孙响波， 于妮娜， 潘月丽

实验论著

肾综颗粒对肾病综合征大鼠微炎症的影响

孙响波， 于妮娜， 潘月丽

目的探讨肾综颗粒对肾病综合征大鼠微炎症的影响。方法将40只SPF级雄性Wistar大鼠随机选取8只大鼠作为正常组，其余32只大鼠制备肾病综合征模型，造模成功后随机分为模型组、激素组、肾综颗粒组、激素加肾综颗粒组，每组8只。除正常组、模型组外，其余各组分别予激素、肾综颗粒、激素加肾综颗粒干预，检测血清核因子κB(NF-κB)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)水平。结果激素加肾综颗粒组能显著降低肾病综合征大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP水平，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论激素加肾综颗粒组对肾病综合征大鼠微炎症状态具改善作用，其作用机制可能是通过降低IL-1β、TNF-α水平，减少IL-6的分泌，使C反应蛋白、NF-κB含量降低等减慢炎症因子的致炎效应，阻断炎症进程。

肾病综合征； 肾综颗粒； 微炎症； 大鼠

微炎症即炎性蛋白、炎性因子升高的非显性免疫炎症状态[1-2]。炎症细胞因子和炎症反应可能参与原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome，PNS)的发病[3]。诸多研究发现PNS患者普遍存在着微炎症反应，微炎症发病机制尚未明确，但细胞因子分泌紊乱与微炎症状态的发生密切相关，微炎症对PNS的发生、发展、预后都具有重要临床意义[4-5]。我们前期研究发现肾综颗粒对临床PNS患者治疗有效，本研究通过复制阿霉素肾病综合征大鼠模型，进一步探讨肾综颗粒对大鼠模型血清核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平影响，阐释其改善微炎症状态的干预机制，从改善微炎症角度为临床治疗PNS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性Wistar大鼠40只，8周龄，体质量220 g，购于山东大学实验动物中心[许可证号：SCXK(鲁)2009-0001]。泼尼松片(5 mg/片)，肾综颗粒(由黄连、黄芩、黄柏、当归、川芎、桃仁、红花、栀子、生地黄、赤芍、柴胡、三七粉、甘草组成，本院药剂科制作)，阿霉素针(10 mg/支)，EL340i型全自动酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司]；GL20A型全自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂)；SSW型电热恒温水浴箱(上海博迅实业有限公司)；IL-1β测试盒(批号：E-30418)、IL-6测试盒(批号：E-30644)、TNF-ɑ测试盒(批号：E-30633)、NF-κB测试盒(批号：E-30512)、C反应蛋白测试盒(批号：E-30458)，试剂盒全部由厦门慧嘉生物科技有限公司提供。

1.2 模型制备 将40只大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法选取8只大鼠作为正常组，其余32只大鼠参照文献[4]方法制备模型，32只大鼠进行盐酸阿霉素6.5 mg/kg尾静脉注射，正常组进行生理盐水尾静脉注射，注射后将大鼠饲养于代谢笼中，自由摄食饮水，1周后开始记录尿蛋白定性情况，当尿蛋白定性≥+++时，24 h尿蛋白定量≥100 mg/kg，并持续3 d以上者，即为造模成功。

1.3 实验方法 造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、激素组、肾综颗粒组、激素加肾综颗粒组，每组8只，正常组与模型组给予等量生理盐水灌胃，肾综颗粒组予肾综颗粒9 g/kg灌胃；激素组给予泼尼松5.4 mg/kg灌胃，激素加肾综颗粒组，以肾综颗粒9 g/kg、泼尼松5.4 mg/kg灌胃。于造模成功后每日1次，共12周。实验过程中模型组、激素组大鼠各死亡2例，肾综颗粒组、激素加肾综颗粒组各死亡1例，死亡大鼠消瘦严重。

1.4 观察指标 实验从第12周的20：00禁食不禁水12 h，次日全部大鼠称重，用水合氯醛腹腔注射麻醉10 mL/kg，打开腹腔，经腹主动脉采血，静置1 h，促凝管血样迅速低温离心(4 000 r/min，10 min，4 ℃，离心半径77 mm)，分离血清，分别用于IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、C反应蛋白含量检测，其测定方法严格按照试剂盒说明书提供的方法进行操作。

2 结果

各组大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、C反应蛋白含量比较见表1。

表1 各组大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP含量比较

注：与模型组比较，aP<0.05；与激素组比较，bP<0.05。

表1结果表明，与激素组和肾综颗粒组比较，激素加肾综颗粒组能明显降低肾综大鼠模型血清IL-6、CRP、NF-κB、IL-1β、TNF-α含量，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

PNS目前主要以西医治疗为主要方法，但其病程长，激素毒副作用大，且复发率高，治疗颇为棘手，中西医结合方法在临床得到广泛应用，取得较好效果，目前中医药治疗PNS在减少PNS复发，消除蛋白尿，减轻激素、细胞毒性药物毒副作用中取得了很好的疗效[6]。中医学中无肾病综合征相关文献，究其发病特点、临床表现及其预后转归等，符合中医学“水肿病”的讨论诊治范畴。本病属本虚标实之证，以脾、肺、肾三脏之虚为本，以风邪、水湿、疮毒、瘀血为四标。气血痰与虚湿瘀病机为PNS的基本病机[7-9]。湿热为蛋白尿主因，“湿”作为主要病机贯穿整个疾病发展全过程[10]，临证以擅用清热解毒利湿，活血化瘀，益气养阴，健脾补肾等法施治PNS[11]。肾综颗粒是在黄连解毒汤与桃红四物汤基础上加柴胡、甘草、三七而成。黄连、黄芩、黄柏、栀子为君药，黄连解毒汤具苦寒直折，泻火解毒功效，多用于实热火毒、三焦热盛之证。臣以桃仁、红花、生地、赤芍、当归、川芎，桃红四物汤以活血，辅以行气、养血，配伍后使瘀血得化、新血得生、气机调畅。佐以柴胡引药入肝，升达清阳，调畅气机，三七善祛瘀生新，活血定痛，且补血止血。甘草补脾和中，助归芍成气虚之功，助黄芩、黄连、黄柏清热解毒，合芍药缓急止痛，又可调和诸药。前期临床研究证实，激素加肾综颗粒治疗PNS能明显下调PNS患儿血脂和超敏C反应蛋白水平，对PNS患儿“微炎症”状态有明显改善作用[12]。PNS患儿免疫功能紊乱导致对促炎性细胞因子的清除能力减弱，使得循环血液中炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、CRP等急性时相蛋白水平增高。PNS患者血清中的炎症指标CRP、IL-6水平均较健康人显著增高，提示PNS患者体内确实存在着微炎症状态[13]。有研究证实IL-1β和TNF-α可诱导培养的人肾小球系膜细胞中NF-κB活化[14-15]。小儿PNS发病时IL-1β、IL-6、NF-κB等炎症介质而加重肾脏损害，IL-1β参与PNS的发病，可加重病情的进展，终致使肾小球硬化、纤维化。IL-1β是参与PNS的重要炎症因子，IL-6促进B细胞增殖，可诱导其他细胞因子如IL-1、IL-2和TNF-ɑ等产生及释放，并且可增强IL-1和TNF-ɑ等炎症的破坏作用；CRP可诱导单核细胞产生炎症因子和组织因子，促进炎症的发生发展，是微炎症状态的一项客观、敏感的指标，NF-κB是参与了多种炎症反应的一种细胞因子，可介导多种炎性因子的活化、促进纤维化因子的合成，致使细胞外基质沉积，促进微炎症的发生。前期研究发现，肾综颗粒能显著缓解毒瘀互结型PNS的症状，降低尿蛋白，改善高凝状态，且能有效制约激素副作用[16]。与正常组比较，模型组、激素组、肾综颗粒组、激素加肾综颗粒组大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP含量明显升高，提示PNS大鼠血清细胞因子分泌紊乱，处于微炎症状态。与模型组比较，激素组、肾综颗粒组、激素加肾综颗粒组均可降低PNS大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP水平；与激素组比较，激素组加肾综颗粒组能显著降低PNS大鼠血清NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP水平，可见，激素加肾综颗粒组疗效优于单用激素组和肾综颗粒组。因此我们推测肾综颗粒对PNS大鼠微炎症具有效改善作用，其作用机制与调节细胞因子水平相关，抑制炎性因子IL-1β、TNF-ɑ、IL-6、CRP等产生与释放，通过下调IL-1β、TNF-ɑ，减少IL-6分泌，降低CRP、NF-κB含量，减慢炎性因子的致炎效应，阻断炎症通路。

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EffectofShenzonggranuleonmicro-inflammationintheratswithprimarynephroticsyndrome

SUNXiangbo，YUNina，PANYueli.

QingdaoHaiciMedicalGroup，Qingdao266000，China

ObjectiveTo study the effect of Shenzong granule on micro-inflammation in the rats with nephritic syndrome.MethodsOf 40 SPF male Wistar rats,8 were chosen randomly as the normal control group (group A),and the remained 32 rats were made into nephrotic syndrome models,which were then divided into 4 groups with 8 in each group:model group(B),hormone group(C),Shenzong group(D) and hormone plus Shenzong group(E).Group C，D and E were intervened respectively with hormone,Shenzong granule and hormone plus shenzong granule;detect the level of serum neuclear factor κB(NF-κB),interleukin 1β(IL-1β),tumor necrosis factor α(TNF-α),IL-6,and C-reactive protein(CRP).ResultsThe level of NF-κB,IL-1β,TNF-α,IL-6 and CRP in rats with nephrotic syndrome was significantly reduced in group E,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionThe micro-inflammation in rats with nephrotic syndrome is improved by hormone and Shenzong granule. Its working mechanism may be through reducing IL-1β and TNF-α level,the IL-6 secretion,and decreasing the content of CRP and NF-κB,which results in slowing down the reaction of inflammation factors and blocking the inflammation.

Nephrotic syndrome; Shenzong granule; Micro-inflammation; Rat

山东省自然科学基金项目(2012ZRB14098)

266000 山东 青岛，青岛市海慈医疗集团(青岛市中医医院)肾病科

孙响波(1982-)，男，医学博士，主治医师。研究方向：中医药治疗肾病的临床与实验研究

孙响波，E-mail：sunxiangbo1982@163.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.06.003

R-332

A

1674-3865(2017)06-0472-03

2016-11-08)

吴迪)