甘露消毒丹及其挥发油对流感病毒感染小鼠RIG-Ⅰ/NF-κB信号通路的影响

刘光华， 刘娟， 高畅， 张聪聪， 贾晓妍

实验论著

甘露消毒丹及其挥发油对流感病毒感染小鼠RIG-Ⅰ/NF-κB信号通路的影响

刘光华， 刘娟， 高畅， 张聪聪， 贾晓妍

目的观察甘露消毒丹及其挥发油对流感病毒感染小鼠血清中白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素α/β(IFN-α/β)含量及肺组织中非结构蛋白1(NS1)、维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ) mRNA、核因子κB(NF-κB)蛋白的影响，以探讨甘露消毒丹及其挥发油抗病毒作用的分子机制。方法选择SPF级BALB/c小鼠36只，雌雄各半，随机分为6组，分别为正常组、模型组、灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组，每组6只。除正常组外，其余5组以流感病毒FM1-6-E2滴鼻造模。于造模后第7天，摘眼球放血处死小鼠，通过透射电子显微镜对肺组织进行检测以及图像分析，采用ELISA法测定血清中IL-4、TNF-α、IFN-α/β含量，qRT-PCR检测各组小鼠肺组织中NS1、RIG-Ⅰ mRNA的表达，Western blot方法测定各组小鼠肺组织NF-κB蛋白的表达。结果(1)流感病毒感染后模型小鼠肺组织超微结构可见Ⅱ型细胞坏死、肺泡结构破坏，肺泡腔内纤毛增粗、脱落，形成肺部炎症；各治疗组均可改善肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构的异常改变。(2)流感病毒感染小鼠后，血清中IL-4、TNF-α、IFN-α/β的含量及肺组织中的NS1、RIG-Ⅰ mRNA、NF-κB蛋白表达均高于正常组，模型组与正常组比较，差异显著；与模型组比较，灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组血清中IFN-α/β含量显著升高，IL-4、TNF-α含量及NS1 mRNA、RIG-ⅠmRNA、NF-κB蛋白表达明显下调(P<0.05)，甘露消毒丹各治疗组不同剂型抗流感病毒作用差异有统计学意义(P<0.05)，灌胃滴鼻合用组>灌胃组>滴鼻组。结论甘露消毒丹具有抗流感病毒感染的作用，通过抑制RIG-Ⅰ/NF-κB信号传导通路的活化，阻止炎症的病理反应，提高免疫因子含量，降低流感病毒引起的免疫炎性损伤。

流感病毒感染； 甘露消毒丹； 挥发油； RIG-Ⅰ； NF-κB； 小鼠

流感病毒感染是一类具有高发病率和高死亡率的传染性病毒，其所致感染性疾病可引起全球范围内流行[1]。中医药在防治流感中所发挥的作用日趋受到国内外医学界专家的高度重视[2-4]。甘露消毒丹乃“湿温时疫之主方”，应用于临床各科感染性病变均有显著疗效，尤适于急性外感热病湿热证的治疗[5]。现代药理学研究表明，甘露消毒丹除能抑制杀灭病毒，阻止病毒复制，还能够加强抗病毒能力，并能诱生干扰素和加强干扰素诱导以提高机体免疫力[6]。机体的天然免疫系统在抗病毒感染方面发挥着重要的作用，模式识别受体中的RIG-Ⅰ样受体是细胞质中一类RNA解旋酶，能够识别病毒复制产生的RNA，对抗病毒天然免疫的建立起着非常重要的作用[7]。本实验拟采用流感病毒感染小鼠，应用不同技术检测小鼠血清中白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素α/β(interferon-α/β，IFN-α/β)含量及肺组织非结构蛋白(nonstructural protein，NS1)、维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ) mRNA、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)蛋白的变化，探讨甘露消毒丹及其挥发油抗流感病毒作用，及其与RIG-Ⅰ/NF-κB信号通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)，由中国预防医学科学院病毒研究所提供，冻存于辽宁中医药大学附属医院病毒室。

1.1.2 实验动物 SPF级BALB/c小鼠36只，体质量(20±2)g，雌雄各半，购买于辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(辽)2013-0009，使用许可证号：SYXK(辽)2015-0001。

1.1.3 药物 甘露消毒丹药物组成：滑石、黄芩、茵陈、石菖蒲、川贝母、木通、藿香、连翘、白蔻仁、薄荷、射干，中药饮片均购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局，经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定为正品。饮片以8倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次1 h，合并每组3次提取的药液，回收溶剂并浓缩，制成含生药1 g/mL混悬液。挥发油制备：将中药粉碎，加8倍量水浸泡，装入冷凝器中，水蒸气蒸馏提取6 h，分层分取挥发油，制成含生药6 g/mL的药液。阳性对照药物：磷酸奥司他韦颗粒(宜昌长江药业有限公司，批号：0371609002)75 mg，配成1 g/L的溶液。每组药液分别4 ℃保存备用。

1.1.4 试剂 小鼠IL-4、TNF-α ELISA试剂盒、Phospho-NF-κBp65(S529)一抗(BM3994)、ECM Ⅱ of Western Blotting检测试剂盒浓缩型兔IgG二抗、GAPDH(武汉博士德生物工程有限公司)，IFN-α/β ELISA试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司)，Trizol总RNA提取试剂(Invitrogen公司)，qRT-PCR试剂盒、DEPC、DNA marker DL2000(大连宝生物工程有限公司)。根据文献[8-9]合成引物NS1、RIG-Ⅰ，NS1上游5′-ATG GAT CCA AAC ACT GTG TC-3′，下游5′-TCA AAC TTC TGA CCT AAT TGT TCC-3′，RIG-Ⅰ上游5′-GCA GGT TAC TGT GGA CTT TGT G-3′，下游5′-TGC CAT TCT CCC TTT AGT GTC T-3′，购于北京六合华基因公司，25%戊二醛(天津福晨化学试剂厂)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药方法 将36只BALB/c小鼠按随机数字表法分为6组：正常组、模型组、灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组，每组6只。灌胃组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组于感染后24 h开始灌胃给药，每日1次，每次0.3 mL，滴鼻组、灌胃滴鼻合用组于感染后24 h开始滴鼻给药，每日1次，每次0.04 mL。正常组、模型组同步灌胃给生理盐水0.3 mL。最后一次给药后禁水、禁食4 h。

1.2.2 模型制备 实验动物适应性饲养1 d后称重，除正常组外，其余动物均制备流感病毒感染模型。在乙醚轻度麻醉下，经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株(0.1 mL/只)。正常组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种生理盐水0.1 mL。

1.2.3 标本采集及检测方法 于造模后第7天采集标本，每组取6只，称动物体质量后，摘除眼球取血后杀死并解剖小鼠，取血后储存于促凝管中，后放入离心机中以4 000 r/min的速度离心5 min，离心后取上层血清存于EP管中，放入-80 ℃冰箱中冷藏以备ELISA检测，取出小鼠的全肺以做qRT-PCR检测样本。取约1 mm×1 mm×1 mm左下肺组织在4 ℃下用2.5%戊二醛固定，用透射电镜进行观察。血清中IL-4、TNF-α、IFN-α/β含量采用ELISA法测定，检测程序按照试剂盒说明书进行；肺组织中的NS1、RIG-Ⅰ mRNA的表达采用qRT-PCR法检测，将取出的各组小鼠肺组织制造细胞悬液，用TRIZOL提取细胞总RNA。分析RNA的纯度及完整性，检测RNA质量合格后，进行反转录，以反转录产物为模板，设计并合成NS1、RIG-Ⅰ的引物，进行qRT-PCR检测；肺组织中NF-κB的蛋白表达采用Western blot检测，用总蛋白提取试剂提取总蛋白，离心取上清液，-20 ℃冰箱中保存。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，用蒸馏水调整到统一浓度，提取液中加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃变性10 min，蛋白上样每孔含10 μL，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜30 min，2%牛血清白蛋白室温封闭2 h。一抗室温孵育2 h，4 ℃过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。ECL发光，Fluor Chem Q蛋白质印迹，成像系统显色。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，两组计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜下观察小鼠肺超微结构 正常组可见Ⅱ型肺泡上皮细胞结构完整，细胞游离面微绒毛丰富，细胞间连接较紧密(图1a,见封三)。模型组病变可见核不规则，核染色质凝集粗块，间质胶原纤维大量堆积，排列纵横交错，细胞坏死(图1b,见封三)，肺泡腔内纤毛增粗、脱落(图1c,见封三)，肺泡结构破坏(图1d,见封三)。各药物治疗组Ⅱ型肺泡细胞数目增多，板层小体形态规整、数量较少，绒毛较丰富，肺泡隔增厚不明显，间质内见少量的胶原纤维。

2.2 小鼠血清中各细胞因子的变化 见表1。

表1 甘露消毒丹及其挥发油对血清中IFN-α/β和IL-4、TNF-α含量的影响

注：与模型组比较，aP<0.05；灌胃滴鼻合用组，bP<0.05；与奥司他韦组比较，cP<0.05。

表1结果表明，流感病毒感染后小鼠血清中IFN-α/β含量显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组和奥司他韦组血清中IFN-α/β含量显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、奥司他韦组血清中IFN-α/β含量显著低于灌胃滴鼻合用组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组血清中IFN-α/β含量显著高于奥司他韦组，差异有统计学意义(P<0.05)。滴鼻组血清中IFN-α/β含量与奥司他韦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组升高血清IFN-α/β含量总体疗效可见：灌胃滴鼻合用组>灌胃组>滴鼻组>奥司他韦组。

流感病毒感染小鼠后，模型组血清中IL-4水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组血清中IL-4水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。滴鼻组血清中IL-4水平显著低于灌胃滴鼻合用组，差异有统计学意义(P<0.05)；灌胃组、奥司他韦组血清中IL-4水平与灌胃滴鼻合用组比较差异无统计学意义(P>0.05)。灌胃组、滴鼻组血清中IL-4水平与奥司他韦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组降低血清IL-4疗效总体可见：灌胃滴鼻合用组>灌胃组>奥司他韦组>滴鼻组。

流感病毒感染小鼠后，模型组血清中TNF-α水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组血清中TNF-α水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、奥司他韦组血清中TNF-α水平显著高于灌胃滴鼻合用组，差异有统计学意义(P<0.05)。滴鼻组血清中TNF-α水平显著高于奥司他韦组，差异有统计学意义(P<0.05)；灌胃组血清中TNF-α水平与奥司他韦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组降低血清TNF-α疗效总体可见：灌胃滴鼻合用组>奥司他韦组>灌胃组>滴鼻组。

2.3 qRT-PCR检测NS1、RIG-Ⅰ mRNA的水平 见表2。

表2 甘露消毒丹及其挥发油对小鼠肺组织内NS1、RIG-Ⅰ mRNA水平的影响

注：与模型组比较，aP<0.05；与灌胃滴鼻合用组比较，bP<0.05。

表2结果表明，各治疗组小鼠肺组织内RIG-Ⅰ mRNA水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、奥司他韦组肺组织内RIG-Ⅰ mRNA表达显著高于灌胃滴鼻合用组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组肺组织内RIG-Ⅰ mRNA表达与奥司他韦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组间降低肺组织RIG-Ⅰ mRNA表达总体疗效可见：灌胃滴鼻合用组>灌胃组>滴鼻组>奥司他韦组。

小鼠感染流感病毒后，灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组肺组织中NS1 mRNA表达显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、奥司他韦组肺组织中NS1 mRNA表达显著高于灌胃滴鼻合用组，差异有统计学意义(P<0.05)；滴鼻组肺组织中NS1 mRNA表达与灌胃滴鼻合用组比较差异无统计学意义(P>0.05)。灌胃组、滴鼻组肺组织内NS1 mRNA表达与奥司他韦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组间降低肺组织NS1 mRNA表达总体疗效可见：灌胃滴鼻合用组>滴鼻组>奥司他韦组>灌胃组。

2.4 Western blot检测磷酸化NF-κB蛋白水平 见表3和图2。

表3 甘露消毒丹及其挥发油对小鼠肺组织内NF-κB蛋白水平的影响

注：与模型组比较，aP<0.05；与灌胃滴鼻合用组比较，bP<0.05；与奥司他韦组比较，cP<0.05。

表3结果表明，小鼠造模后肺组织中NF-κB蛋白表达水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、灌胃滴鼻合用组、奥司他韦组肺组织中NF-κB蛋白表达显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组、奥司他韦组肺组织内NF-κB蛋白表达显著高于灌胃滴鼻合用组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃组、滴鼻组肺组织内NF-κB蛋白高于奥司他韦组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组疗效总体可见：灌胃滴鼻合用组>奥司他韦组>灌胃组>滴鼻组。

图2 流感病毒感染小鼠肺组织NF-κB蛋白表达

3 讨论

流感病毒属于正黏病毒，为单股负链RNA病毒，在病毒复制过程中，NS1作为流感病毒唯一具有多种活性的调控因子的非结构蛋白，参与其复制和传播。在感染的早期，大量存在于细胞核中，而在感染的晚期，NS1蛋白也可出现于细胞浆中，且能刺激机体产生抗NS1蛋白的抗体[10]。NS1蛋白能通过与RNA结合，抑制IFN-a/β的产生和释放[11]，与流感病毒所诱导的细胞凋亡之间存在一定的联系[12]。近年研究发现天然免疫系统中的模式识别受体在急性肺损伤的发病机制中具有重要的作用。RIG-Ⅰ样受体能够识别细胞质中的病毒RNA，启动信号转导，导致Ⅰ型IFN的活化[13]和NF-κB的入核[14]。在RIG-Ⅰ样受体识别病毒RNA后，引起MAVS的活化，进而将信号转导给下游，活化IRF3/7[15]，进而转移至细胞核内，并诱导Ⅰ型IFN的产生。而活化的MAVS还可将信号转导给IKK复合物(包含IKKα、IKKβ、IKKγ)，最后导致NF-κB和IκB α复合物的磷酸化，磷酸化的IκB α从NF-κB上脱落并降解，活化的NF-κB入核，促进促炎因子和炎性趋化因子的产生[16]。本实验发现流感病毒感染组小鼠肺组织内NS1、RIG-Ⅰ mRNA水平显著升高(P<0.05)，NF-κB蛋白的表达增高(P<0.05)，血清中的IL-4、TNF-α、IFN-α/β含量亦明显升高(P<0.05)，RIG-Ⅰ/NF-κB信号通路被激活。流感病毒主要侵入机体呼吸道黏膜上皮细胞，并繁殖、复制，引起细胞产生空泡、变性并迅速产生子代病毒体扩散至邻近细胞，再周而复始，重复病毒增殖周期。本实验通过电镜发现流感病毒感染小鼠的肺组织超微结构可见肺泡腔内纤毛增粗、脱落，Ⅱ型细胞坏死、肺泡结构破坏。本实验通过甘露消毒丹水蒸气蒸馏提取淡黄色挥发油滴鼻与甘露消毒丹醇提物灌胃作用于流感病毒感染的小鼠，发现甘露消毒丹灌胃滴鼻合用能够显著的控制肺部炎症，抑制RIG-Ⅰ mRNA、NF-κB蛋白的过度表达，同时能提高IFN-α/β含量，降低IL-4、TNF-α的含量，较单一挥发油组效果显著；在抑制NS1 mRNA升高方面，甘露消毒丹滴鼻组的效果较灌胃组更加显著，提示鼻黏膜给药抑制呼吸道病原体感染具有一定优势。

流感病毒归属中医学“瘟疫”“温病”等范畴，为感受非时之气或疫疠之邪，外淫肌腠，内蕴肺胃而为病。其发病与机体免疫功能的失调和降低密切相关。甘露消毒丹为治湿热时疫经典方，针对“热、毒、湿、浊”组方，由滑石、黄芩、茵陈等11味中药组成。该方苦辛芳香，能清热利湿、化浊解毒，非苦寒不能清其热，非淡渗不能利其湿，故必然分治之。其中黄芩、连翘，苦寒清热，热清则湿邪易祛；重用茵陈、滑石，湿邪得去，则热势必孤。又因湿热郁蒸，易于成毒成浊，故于清热渗利之中，配以芳香辟秽之藿香、白豆蔻、薄荷，故毒可解，浊可化[17]。其方中连翘、黄芩均具有广谱抗菌、抗流感病毒、解热镇痛的作用[18]；茵陈、石菖蒲、藿香、薄荷、白豆蔻等芳香类药材富含挥发油，茵陈挥发油能够抑制炎性递质表达[19]，薄荷油可以干扰病毒包膜结构[20]。挥发油是一类由小分子物质组成，具有芳香开窍、引药上行作用，可被机体迅速吸收的油状挥发性液体。甘露消毒丹挥发油具有明显的抗炎、抗病毒作用，且滴鼻给药方式简便快捷，具有广泛应用空间。

本研究发现甘露消毒丹具有抗流感病毒感染的作用，通过免疫调节降低流感病毒引起的免疫炎性损伤，抑制RIG-Ⅰ/NG-κB表达、增加IFN-α/β含量及降低IL-4、TNF-α的分泌，是其作用机制之一。甘露消毒丹醇提物及挥发油合用，即一方两用，既能抑制NF-κB的活性，阻止炎症的病理反应，又能提高免疫因子含量，较单一给药更有优势，其深入作用机制有待于进一步研究。

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EffectsofGanluXiaodumicropillanditsvolatileoilonRIG-Ⅰ/NF-κBsignalingpathwayinmiceinfectedwithinfluenzavirus

LIUGuanghua，LIUJuan，GAOChang，ZHANGCongcong，JIAXiaoyan.

MedicalDepartmentofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China

ObjectiveTo observe the effects of Ganlun Xiaodu micropill(GXM) and its volatile oil on the levels of IL-4, TNF-α, IFN-α/β and NS1 mRNA, RIG-Ⅰ mRNA and NF-κB protein in lung tissue of mice infected with influenza virus(IV)， in order to explore the molecular mechanism of the antiviral effect of GXM and its volatile oil.MethodsA total of 36 SPF BALB/c mice， half female and half male， were randomly divided into 6 groups， with 6 rats in each group. They were normal group(A group)， model group(B group)， gavage group(C group)， intranasal group(D group)， combination group(E group) and oseltamivir group(F group). Except the normal group， the remained 5 groups were modeled with influenza virus FM1-6-E2. On the seventh day after the model， the mice were killed by picking up the eyeball and releasing blood. The lung tissue was detected by transmission electron microscope and the image was analyzed. The content of IL-4, TNF-α and IFN-α/β in serum was determined by ELISA，and the expression of NS1 and RIG-ⅠmRNA in lung tissue of mice was detected by qRT-PCR. Western blot method was used to determine the expression of NF-κB protein in lung tissues of mice.Results(1) The ultrastructure of lung tissue in the model mice after IV infection showed necrosis of type Ⅱ cells， destruction of alveolar structure， thickening and shedding of cilium in the alveoli， and pulmonary inflammation was formed. All the treatment groups were improved in the ultrastructural abnormal change of the alveolar type Ⅱ epithelial cells.(2) After IV infection in mice， the content of IL-4, TNF-α and IFN-α/β in serum and the expression of NS1 mRNA, RIG-Ⅰ mRNA and NF-κB protein in lung tissues were all higher than those in A group. The difference was significant between B group and A group; Compared with the B group， the serum levels of IFN-α/β in the serum of C，D，E and F groups increased significantly， while the content of IL-4， TNF-α and the expression of NS1 mRNA， RIG-Ⅰ mRNA and NF-κB protein were obviously down-regulated (P<0.05). There was significant difference in the anti-IV effect among different dosage forms of GXM treatment groups(P<0.05)，the effect being E group>C group>D group.ConclusionGXM has the function of anti-IV infection. It inhibits the pathological reaction of inflammation， enhances the content of immune factors and reduces the immune inflammatory injury induced by IV by inhibiting the activation of RIG-Ⅰ/NF-κB signaling pathway.

Influenza virus infection; Ganlu Xiaodu micropill; Volatile oil; RIG-Ⅰ; NF-κB； Mice

国家自然基金青年项目(81403293)

110847 沈阳，辽宁中医药大学基础医学院温病学教研室(刘光华)；辽宁中医药大学中医儿科学专业研究生(刘娟，高畅，张聪聪，贾晓妍)

刘光华(1974-)，女，医学博士，副教授，硕士研究生导师。研究方向：中医药防治感染性疾病

刘光华，E-mail:liugh76@sohu.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.06.001

R-332

A

1674-3865(2017)06-0461-06

2017-10-23)

刘颖)