自噬在肾小管上皮细胞损伤中的研究进展

袁芳+郭鹏威+尤燕舞

【关键词】自噬；肾小管上皮细胞；信号通路

中图分类号：R692.9 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.06.025

自噬（autophagy）是细胞依赖溶酶体途径，是高度保守地对胞内蛋白和部分细胞器（如线粒体、内质网）进行降解的过程，对维持细胞增殖、分化，稳定细胞内环境及促进异常细胞凋亡有重要作用。研究发现，肾缺血-再灌注（Ischemic reperfusion，I/R）损伤、脓毒症肾损伤、肾间质炎症、纤维化和慢性肾脏病等肾小管间质疾病的发病机制与凋亡有不同程度的关系，而自噬与凋亡在某些方面有一定关系，由此，自噬在肾小管上皮细胞（tubular epithelial cells，TECs）损伤中很可能有重要作用。然而，导致这些损伤的机制尚不明确。笔者从分子生物学角度就自噬的分类、形成、信号通路调控的研究进展进行综述。

1自噬的概念及分类

自噬是存在于高等动物细胞中的普遍生命现象[1]，是真核细胞在缺氧、炎症等环境压力条件下，依赖溶酶体途径对胞内损伤或衰老的蛋白质及细胞器进行降解的代谢过程，对维持细胞内环境稳态有重要作用。过去普遍认为自噬是一个非选择性的过程，而目前研究发现自噬是一个可被诱导和精准选择的过程[2]。

自噬是一种程序化的胞内降解过程。20世纪60年代，它首次被描述为本体降解系统，通过溶酶体途径灭活水溶性大分子（如核酸、蛋白質、碳水化合物、脂类）和衰老的细胞器（如线粒体、核糖体、过氧化物酶体、内质网）[3]，得以满足细胞代谢、细胞器更新和细胞内环境稳态的需要。正常生理环境下，自噬能够清除细胞内“杂物”，维持细胞的正常生理功能；应激（如饥饿、缺氧、缺血、氧化应激）条件下，自噬活动增强，导致大量蛋白质及细胞器被过度自我消化，引起细胞结构和功能的不可逆损害。

根据进入溶酶体的途径，自噬过程可分为三种主要类型：（1）巨自噬 （macroautophagy）：来自非溶酶体途径的双层膜结构将胞内可溶性蛋白质和变性坏死的细胞器包裹，形成吞噬泡，逐步扩大形成自噬体，最后运送至溶酶体继而被降解。此过程中的双层膜可能形成于线粒体膜[4]、高尔基体膜[5]或内质网膜[6]。进一步研究发现，部分细胞器存在特异性自噬现象，比如发生在线粒体的线粒体自噬（mitophagy）、发生在核糖体的核糖体自噬（ribophagy）、发生在内质网的内质网自噬（reticulophagy）、发生在过氧化物酶体的过氧化物酶体自噬（pexophagy）、发生在部分脂类的脂类自噬（lipophagy）[7]。（2）微自噬（microautophagy）：溶酶体膜直接内陷，将待降解蛋白质及细胞器包裹然后将其降解。（3）分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy）：蛋白水解系统选择性地将底物蛋白靶向转运到溶酶体，溶酶体内腔在两侧的膜和易位专用蛋白的协助下完成特定蛋白质的降解[8]。其中，巨自噬是最常见也是最重要的一种，一般所说的自噬通常是指巨自噬。

2细胞自噬相关基因及分子组成

根据分子遗传学，自噬的形成过程和发展受多种自噬相关基因（autophagy associated gene，Atg）的调控。Atg发现于20世纪90年代，其参与调节细胞自噬的信号通路的解剖提高了我们对溶酶体降解途径发生和发展的认识[9]。其编码的多种蛋白对自噬体的形成和成熟有重要作用[10]。Atg从酵母菌进化到人类具有高度保守性，酵母Atg只有一种，而人类有很多亚群（Atg1，Atg4，Atg8和Atg18等），这些亚群的功能还有待研究。

Atg系统在自噬过程中有重要作用。它有两个类泛素样蛋白质及其连接系统-Atg12与LC3（酵母同源Atg8蛋白）。前者主要由Atg12-Atg5-Atgl6复合物组成，负责LC3连接系统的激发和定位；后者通常作为自噬体的标记物[11]。泛素样蛋白Atg12被Atg7（E1样酶）激活，在Atg10（E2样酶）协同下转运至Atg5，最终形成一个Atg12-Atg5接合体，与Atg16以2∶2∶2的形式形成Atg12-Atg5-Atg16复合物，参与自噬体的扩大。另一个连接系统LC3的修饰也需要E1样酶和E2样酶的参与。LC3前体由Atg4修饰后形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ与其脂质结合位点（PE）结合，被Atg7（E1样酶）和Atg3（E2样酶）作用后形成脂溶性的LC3-Ⅱ-PE。LC3-Ⅱ形成后能够结合在自噬体膜上，因此LC3-Ⅱ常用作自噬形成的标志[12]。Jiang等[13]在单侧肾血管被夹闭的小鼠RIR模型中发现再灌注后的48 h内LC3-Ⅱ以及自噬体明显增加；而应用氯喹等自噬抑制剂的小鼠在经过28 min的缺血及随后的血流再灌注后，小鼠血清中肌酐和尿素迅速升高。由此表明，自噬在肾缺血-再灌注损伤中有保护作用。

unc-51样蛋白酶（unc-51 like kinase 1，ULK1）复合物在自噬过程有重要作用。它由ULK1（Atg1同系物）、Atg13、FIP200（Atg17同系物）三种蛋白组成。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）与ULK1复合物相互作用调节自噬的发生。mTORC1通过与ULK1复合物结合，使ULK1、Atg13发生磷酸化，从而抑制细胞自噬。能量不足或AMP向ATP转化率升高时，mTORC1活性受到抑制，从ULK1复合物分离，ULK1被激活而发生自我磷酸化，磷酸化的ULK1使得Atg13、FIP200磷酸化，从而诱导自噬的发生。反之，能量充足时，mTORC1被氨基酸和生长因子活化，从而抑制细胞自噬，支持细胞生长[14]。自噬体的形成需要磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P）的参与[15]，并已证实存在于内质网的特定区域，叫做欧米茄小体[6]。研究数据表明，线粒体膜、细胞膜、核膜也是自噬体形成的场所[16]。hvps34是重要的蛋白复合物，包括调节性蛋白激酶p150、hvps15、Beclin-1和在哺乳动物体最新发现的Atg14L（Atg14类似物）。能量不足条件下，Beclin-1被诱导从Beclin-2解离，hvps34被激活而产生PI3P，PI3P聚集Atg蛋白，促进自噬体的形成。hvps形成两种蛋白复合物：复合物Ⅰ和复合物Ⅱ。前者对自噬有作用，后者与蛋白空泡形成有关。Atg38被定义为复合物Ⅰ的亚单位。在Atg38△细胞，自噬活动明显减弱且复合物Ⅰ分解为vpsl5-vps34和Atgl4-vps30亚单位。生化分析显示Atg38通过C末端聚合，形成Atg38聚合物以保持复合物I的完整性；Atg38通过N末端与Atgl4和vps34结合。这表明Atg38聚合物在物理上连接vpsl5-vps34和Atgl4-vps30亚单位，并促进复合物Ⅰ的形成[17]。endprint

3自噬在肾小管上皮细胞损伤的分子机制

TECs损伤及损伤后的反应是最早出现于肾小管间质的病理生理改变，在肾间质炎症、肾间质纤维化、慢性肾脏病病程的进展中起中心作用。自噬与各种原因导致的TECs损伤有密切关系。而细胞自噬的调节是一个多步骤的错综复杂的过程，人们对其尚未完全掌握，目前已知的调控主要有mTOR、Beclin-1、P53三条途径。

3.1mTOR信号通路 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶家族的成员。mTOR以两种不同形式存在：对雷帕霉素敏感的mTORC1和对雷帕霉素不敏感的mTORC2。前者主要在细胞凋亡、细胞生长、能量代谢和细胞自噬中发挥作用[18]；后者主要参与调控细胞骨架蛋白的形成和存活，而有研究表明，mTORC2也间接调节细胞自噬[19]。其中，mTORC1信号通路是多条信号通路的汇合点，是自噬发生过程的“守门员”，也是目前研究最多的信号通路。mTORC1通过与下游信号分子翻译起始因子4E结合蛋白-1（translation initiation factor 4E -binding protein-1，4EBP1）、核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）作用，启动并调控自噬相关基因的转录和翻译，参与自噬水平的调节[20]。赵鸿等人[21]在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）小鼠肾组织中，用免疫印迹检测到DN小鼠肾组织中mTOR、p-mTOR、p-S6K1均明显上升，为mTORC1信号通路参与细胞自噬提供新的证据。

mTORC1的上游信号通路包括：（1）AMPK-mTORC1信号通路。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种异源三聚体蛋白质激酶，受到外源信号刺激后被激活，向下游信号通路分子mTOR传递信号，通过调控mTOR的活化水平对调节细胞自噬。梁新华等[22]的研究表明D-葡萄糖通过抑制AMPK通路，上调AMPK下游的mTOR通路，而促进人肾小管上皮细胞（HK-2）的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）作用。（2）PI3K/AKT/mTOR信号通路。生理条件下，PI3K被激活后产生第二信使分子PI3P，PI3P在磷脂酰肌醇脂依赖性蛋白激酶1协助下使AKT磷酸化，磷酸化的AKT抑制结节硬化TSC1/2复合物的活化，随之激活mTOR，后者可以从源头阻断自噬的发生。在缺血、缺氧等条件下，AMPK可直接被活化，抑制mTORC1活性并使ULK1磷酸化，进而启动自噬[14]。在高糖培养的肾小管上皮细胞内发现[23]，线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生明显增多，大量ROS通过激活TGF-β1/PI3K/AKT信号通路，使mTOR磷酸化水平升高，进而使E-cadherin表达下降，EMT相关蛋白a-SMA表达增加，细胞发生EMT。（3）Ras-MEK-ERK信号通路。它调节自噬的具体机制尚不明确，但有研究表明ERK通过抑制TSC1/TSC2活性调节细胞自噬[24]。另外，有研究表明Ras能通过PI3K/AKT通路调节细胞自噬水平。

3.2Beclin-1信号通路Beclin-1为酵母自噬基因Atg6同源基因。人Beclin-1蛋白由三个结构域构成，分别是：BH3同源结构域（Bcl-2-homology3）、中央螺旋区（CCD）和进化保守区（ECD）[25]，它们在其他因子协同下调节自噬水平。Beclin-1的CCD和ECD结构域能与PI3KC3形成复合物，上调自噬水平[26]；该复合物中还包括Atg14，后者是Beclin-1自噬依赖磷酸化的关键，但其具体作用机制尚不清楚[27]。Li等[28]在小鼠梗阻性肾病模型发现，梗阻后7～14 d的自噬体、LC3及Beclin-1显著增加，肾小管上皮细胞损伤数量明显增加，程度明显加重。向镜芬等[29]在大鼠脓毒血症造成肾脏损伤模型中，采用Western Blotting检测到LC3、Beclin-1含量随着肾脏损伤时间的推移而上升。张雅丽等[30]的实验发现，在大鼠RIR损伤中肾小管上皮细胞中Beclin-1蛋白表达升高，应用自噬抑制剂氯喹后Beclin-1蛋白表达下降，表明在肾脏缺血损伤过程中细胞自噬被激活。因此，Beclin-1参与并调控自噬水平，其具体作用机制需进一步研究。

3.3P53信号通路P53是一种抑癌基因，被认为是最重要的介导细胞凋亡的基因。研究表明，P53在调控细胞自噬中也有重要作用。P53对细胞自噬水平的影响与其在细胞的定位密切相关[31]。在细胞核中，P53主要通过抑制mTORC1上调细胞自噬水平[32]，还能通过激活损伤相关自噬调节因子（damage-regulated autophagy modulator1，DRAM1），后者可以表达溶酶体蛋白，进而上调自噬水平[33]。另外，P53能激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族，Bcl-2对Beclin-1的抑制作用消失，从而上调自噬水平[34]。关于细胞质中P53的研究表明，被敲除掉P53的癌细胞自噬水平上调，而在胞质中重新转染P53后其自噬水平下调[35]。表明P53在细胞质中的作用是抑制细胞自噬，其机制是P53与FIP200结合，抑制了ULK1-FIP200-Atg13-Atg101复合物的活化，从而对自噬水平起下调作用。Takahashi等[36]在对顺铂诱导鼠肾小管上皮细胞实验发现，与对照组相比，近曲小管自噬缺陷小鼠肾功能损害更严重，其DNA损伤和P53活化更明显；P53在肾小管上皮细胞的上述演变中有极其重要的调控作用。由此可见，P53对细胞自噬水平的影响取决于其在细胞的定位，为靶向上调或下调细胞自噬，从而预防和治疗肾脏间质疾病提供分子生物学依据。endprint

4展望

细胞自噬是一个多步骤，错综复杂的过程，贯穿细胞生长发育全过程。细胞自噬参与肾脏的病理生理过程，与缺血-再灌注肾损伤、肾间质炎症、纤维化和慢性肾脏病等多种常见肾脏病有着密切关系，近年来备受关注。但其分子调节、信号通路等具体机制十分复杂，至今尚未被全面了解。隨着定位于肾小管上皮细胞内部溶酶体途径和自噬平衡的进一步研究，我们有望通过抑制或激活细胞自噬通路，或通过基因修饰等手段在肾脏间质疾病的预防和治疗、改善预后方面取得重大突破。

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（收稿日期：2017-06-16修回日期：2017-06-19）

（编辑：梁明佩）-±s）endprint