果树嫁接亲和性的早期鉴定研究进展

段元杰，杨玉皎，孟富宣，刘海刚

(云南省农业科学院 热区生态农业研究所/元谋干热河谷植物园，云南 元谋 651300)

嫁接亲和是果树繁殖和栽培成功的先决条件，它与果树的生长、结实、果实品质、寿命，以及种质保存和规模化生产等密切相关[1]。嫁接亲和是指嫁接以后砧穗完全愈合生长为共生体，能长期正常生长、结实，并表现出与相同起源类似的特征和状态[2]。木本植物嫁接体发育主要分为愈伤组织形成、胞间连丝形成、维管束连接3个阶段[3]。一般认为砧木和接穗在分类学上关系越接近亲和性越好，也有研究表明单以亲缘关系来评判具有一定的片面性，还可能与多酚类物质含量和种源分布、种源适应性有关[4-5]。嫁接不亲和一般表现为嫁接后无愈伤组织沟通和胞间连丝形成，接穗或植株无法正常生长或死亡；另一类则表现为在嫁接体中有维管束连接，砧穗可以进行水分、无机盐及碳水化合物的交流，但由于维管束连接不连续，生长多年后才表现出不亲和，树体生长缓慢、树势衰弱、嫁接口处断裂、早衰枯死，给生产带来极大损失[6]。因此，明确一套耗时短、结果准确、可在嫁接早期鉴定亲和性的方法具有重要意义。本文从解剖结构、分子生物学、生理生化、微嫁接等方面，概述了果树嫁接早期亲和性鉴定方法的研究进展，以期为果树栽培的科学研究和生产实践提供指导。

1 解剖结构鉴定

嫁接成活过程就是砧穗的愈合过程，其实质是砧木和接穗相互影响、相互作用，通过愈伤组织的产生、对接、融合，维管束分化、连接，结合成一个有机的整体，期间发生着一系列的组织结构变化[7]。

1.1 砧穗解剖结构鉴定

王中英等[8]在杏树组织解剖结构研究中提出，砧木和接穗组织、细胞结构相似，嫁接后亲和性较好。汤丹[9]比较了“富有”甜柿和几种砧木的解剖结构差异，发现“富有”与柿“537号”、浙江柿和油柿在皮层、韧皮部、木质部和髓部面积比例、导管面积和密度等方面存在极显著差异，与“南通小方柿”韧皮部和木质部面积比例、导管面积和密度等较为相似，“富有”嫁接在“537号”、浙江柿和油柿上表现出明显的不亲和现象，嫁接在“南通小方柿”上则愈合良好。骆建霞等[10]从枝皮率、材皮比、细胞相似度、导管及筛管直径和密度等方面，比较了“绿宝”苹果与几种海棠之间的解剖结构差异与嫁接亲和性的关系，发现“绿宝”苹果嫁接到与其组织结构较为相似的八棱海棠和平顶海棠上，嫁接口愈合良好，成活率高，嫁接到与其组织结构差异较大的红果海棠和珠美海棠上的嫁接口愈合较差，砧穗易分离。李鸿莉等[11]以毛葡萄做砧木嫁接3种接穗，观察解剖结构发现，各砧穗之间木质部面积、韧皮部面积、导管面积之间的差异都达到极显著水平，嫁接后砧木和接穗难愈合。也有研究表明以解剖结构的相似程度来预测嫁接亲和性不完全可靠，高志红等[12]观察了甜柿砧、穗的解剖结构和嫁接后愈合情况，发现解剖结构相似的接穗嫁接在同一砧木上表现出不同的亲和性；同一种接穗嫁接在解剖结构差异较大的砧木上却都亲和。

1.2 嫁接体解剖结构鉴定

砧木与接穗的愈合事实上是接触面上各种生活的薄壁细胞在类似“密闭培养”的状态下生长、分化的结果[13]。较早产生较多的愈伤组织并连接沟通，迅速分化出连通的输导组织畅通水分、养分供应，对于嫁接体成活具有积极的作用[14]，可以作为亲和性鉴别的指标。黄曼娜等[15]研究发现“杏叶梨/杜梨”嫁接口愈伤组织的产生速度和嫁接口的愈合进程明显滞后于杜梨本砧嫁接。骆建霞等[10]观察了“绿宝”苹果与不同砧木嫁接后砧穗愈合情况，发现嫁接后“绿宝”/珠美海棠接口处有较厚的隔离层，阻隔了砧穗间愈伤组织沟通，接口愈合较差，砧穗易分离，“绿宝”/八棱海棠的接口处隔离层不明显，愈伤组织迅速愈合并分化出连接通畅的输导组织，植株长势较好。胡梦珏[16]观察了“次郎”嫁接在不同砧木上的砧穗愈合情况，发现“次郎”本砧嫁接愈伤组织形成早，隔离层逐步消失，输导组织连接迅速、畅通无堵塞，亲和性最好；“次郎”/小果甜柿愈伤组织形成、分化缓慢，隔离层突破迟缓，输导组织连接较晚且有部分堵塞，亲和性次之；“次郎”/牛眼柿和“次郎”/君迁子愈伤组织形成较少，分化后仅有少量输导组织连接，亲和性最差。王瑶[17]研究了9个葡萄柚品种与3种砧木的嫁接组合在嫁接后一个月砧穗愈合进程，发现哈路比、瑞路比、里德马叙、里约红以本地酸柚为砧木、星路比以枳壳和美国酸橙为砧木时，隔离层相对较少，愈伤组织产生早并迅速填满嫁接口间隙，砧穗愈合良好。汤丹[9]研究了不同砧木嫁接“富有”甜柿嫁接体的解剖结构变化，发现柿“537号”、浙江柿和油柿直接嫁接“富有”的嫁接口能分化出愈伤组织，但削面细胞大多坏死形成厚重的隔离层，输导组织严重堵塞，表现出明显的不亲和现象；以“南通小方柿”作为中间砧时产生较少的隔离层并逐渐消失，组织结构迅速融合，输导组织连通，愈合较好。陈哲[18]观察了以“井岗红糯”为接穗嫁接在不同荔枝砧木上嫁接体的愈合情况，发现亲和性好的组合砧穗间隔离层消失，维管束桥迅速连通，亲和性差的组合接触面隔离层长期存在，内侧细胞中细胞器较少，鲜见维管束桥连通。刘传荷等[19]观察了山核桃本砧嫁接后嫁接体愈伤反应的超微结构，发现切口处胞间连丝迅速关闭，内层细胞胞间连丝十分活跃，淀粉质体、线粒体、内质网和高尔基体等细胞器大量出现，信息传递和物质交换加强。亲和性好的砧穗组合细胞之间能够相互识别，愈伤组织接触后，逐渐形成连续的胞间连丝[20]。Pina等[21-22]观察分析了李本砧嫁接和以杏为砧木嫁接李的嫁接体愈伤组织细胞之间的交流情况，发现李本砧嫁接的嫁接体能形成连续的胞间连丝，以杏为砧木的嫁接体胞间连丝较少。

2 分子生物学鉴定

嫁接亲和与否和砧穗遗传物质表达相关，嫁接愈合是由砧穗细胞之间表面分子信号交流、起始细胞内信号级联反应来调控基因表达、功能酶合成催化使嫁接口充分愈合形成嫁接嵌合体的过程[23]。

何海洋[24]对美国山核桃嫁接愈合过程中差异表达蛋白进行研究，认为差异蛋白参与了山核桃嫁接愈合过程中多个生理生化过程，与嫁接口愈合密切相关。陈哲[18]用RNA-Seq技术对荔枝嫁接组合的愈合过程进行基因表达谱分析，发现嫁接亲和组中符合筛选条件的差异基因表达数量显著高于嫁接不亲和组，综合分析得出与嫁接亲和性相关的差异基因表达涉及信号转导、信号传递、IAA生物合成、木质素合成等途径。褚怀亮[25]克隆了与山核桃嫁接口愈合相关的TDFs基因，其中20个编码已知功能蛋白的TDFs在砧穗愈合不同时期被诱导或抑制，分析发现它们分别属于物质运输、代谢和能量、细胞周期、信号转导等，并根据所获得的差异表达基因绘制了山核桃嫁接基因调控关系图。郑炳松等[26]在山核桃砧穗嫁接愈合过程中分离得到1个与小麦生长素响应因子部分区段有81%同源性的山核桃嫁接相关cDNA片段，用cDNA-AFLP法研究该基因片段在嫁接过程中的表达变化，发现该片段的表达可能对山核桃嫁接愈合起到调控作用。在进一步的研究中，方佳[27]确定了山核桃生长素响应因子CcARF基因，并研究了嫁接愈合过程中该基因片段转录和翻译对生长素的响应情况，发现用IAA处理的山核桃CcARF基因和蛋白的表达量明显升高，IAA氧化酶的活性下降，用NPA处理的山核桃CcARF基因和蛋白的表达明显受到抑制，IAA氧化酶的活性提高。陈哲[18]对荔枝嫁接愈合过程中木质素代谢途径进行了重点分析，得出LcPOD和LcPAL在不同嫁接组合的愈合过程中均有表达，在嫁接亲和组合中表达丰度明显高于不亲和组合。Irisarri等[28]研究了樱桃苯丙氨酸解氨酶基因ParPAL1和ParPAL2在嫁接愈合过程中的表达情况，发现ParPAL1在嫁接不亲和组合中的表达丰度远高于嫁接亲和组合，ParPAL2仅在不亲和的嫁接组合中表达。Pina等在杏树离体愈伤组织愈合中对PAL表达动态进行监测，也发现PAL在砧穗不亲和的组合中高效转录，表现出较高水平[29]。

3 生理生化鉴定

生理生化指标是植株嫁接亲和性的内在体现，由于砧穗来自不同的个体，嫁接后砧穗在生理上能否成为统一单位、能否无阻碍地进行物质交流决定了嫁接能否成功，砧木、接穗和嫁接口的生理生化特性及代谢产物活性、含量差异会影响嫁接苗的存活，可以在一定程度上反映嫁接亲和性[30]。

3.1 根系活力鉴定

王少华等[31]对葡萄4个嫁接组合进行了研究，得出根系活力与嫁接亲和性密切相关，植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接反映了地上部分的营养状况和产量水平，砧木根系活力强的组合亲和性较好。汤丹等[9]在“富有”甜柿嫁接中研究了不同砧穗组合之间根系活力与植株生长的相关性，认为基砧的根系活力与接穗光合速率等生长指标显著相关，研究嫁接苗的根系活力能了解嫁接亲和性。马攀[30]研究了嫁接后柿不同砧木的根系活力与亲和性之间的关系，发现根系活力强，嫁接亲和性好，反之，亲和性差。董云萍等[32]也认为嫁接后砧木根系活力可以作为反映咖啡嫁接亲和性的指标。

3.2 生物酶活性鉴定

孙华丽等[33]认为PPO能消除单宁等酚类物质的毒害，参与植物呼吸和细胞壁木质素合成；PAL是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶，参与愈伤组织分化、木质素合成，通过比较不同亲和性的鸭梨/豆梨、OHF51/豆梨中酶活性差异，发现在亲和性较好的鸭梨/豆梨中PPO和PAL酶活性保持较高水平。马攀[30]在甜柿嫁接苗亲和性的研究中发现，嫁接苗SOD和POD活性的高低可以作为嫁接苗的早期亲和性预测指标，亲和性好的嫁接苗的SOD、POD活性较高，亲和性差的嫁接苗的SOD和POD活性较低。朱晓慧[34]认为嫁接后POD和CAT活性的增加有利于花椒嫁接体的愈合。严毅[35]分析了葡萄柚砧穗酶活性差值和嫁接愈合部位酶活性高低与亲和性的关系，发现砧、穗愈伤组织POD、CAT、PPO活性差值绝对值越小，嫁接后愈合越好；嫁接愈合部位POD、CAT、PAL活性越高，愈合就越好，SOD和PPO的活性则刚好相反。杨瑞等[36]研究了葡萄不同砧穗组合生理生化指标与植株生长状况之间的关系，结果发现各组合砧穗叶片中的CAT、POD、PPO活性差值绝对值越小，嫁接亲和力就越强。

3.3 代谢物质含量鉴定

黄曼娜等[15]的研究发现杏叶梨/杜梨和杜梨本砧嫁接嫁接口木质素和可溶性蛋白含量变化趋势相同，在亲和性好的杜梨本砧嫁接中木质素含量增加幅度和可溶性蛋白含量显著大于亲和性较差的杏叶梨/杜梨。孙华丽等[33]研究指出亲和性好的嫁接组合愈合部位可溶性糖含量较高，木质素合成时间早，积累量多，多酚类物质呈逐渐减少趋势。朱晓慧[34]研究表明：花椒嫁接体可溶性糖和IAA含量增加，木质素累积有利于嫁接口愈合，酚类物质累积不利于花椒嫁接体的愈合。马攀[30]指出在甜柿不同砧穗嫁接组合中，叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量与嫁接亲和性呈正相关，MDA含量与嫁接亲和性呈负相关。陈哲[18]在荔枝嫁接亲和性研究中指出荔枝砧木和接穗叶片中全钾和可溶性蛋白含量差值的绝对值越小，嫁接亲和性越高。杨瑞等[36]研究表明葡萄砧木与接穗叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白质含量差值的绝对值与嫁接成活率呈极显著负相关。

3.4 光合生理指标鉴定

龚艳箐[37]的研究表明：亲和性较差的红绵蜜抽/枳嫁接一段时间后表现出黄化症状，叶绿素含量急剧减少，全天Ci和Pn保持较低水平，无法正常进行光合作用。王红红[38]对山核桃嫁接亲和性进行了比较研究，发现亲和性较好的绍兴1号/35号和绍兴1号/64号的叶绿素荧光参数、电子传递速率显著高于嫁接亲和性不好的绍兴1号/马汉。徐志龙[39]在嫁接纽荷尔脐橙的2种砧木比较试验中发现亲和性较好的纽荷尔脐橙/Carrizo枳橙叶片的叶绿素总含量、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均高于纽荷尔脐橙/枳。马攀[30]研究了不同的砧木嫁接“富有”、“太秋”、“阳丰”甜柿嫁接苗的光合生理，发现以油柿作为砧木时亲和性较差，叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合速率较低。李莉等[40]在上宋-14核桃的砧木比较试验中发现，亲和性较好的上宋-14/中宁奇最大净光合速率、光饱和点及表观量子效率比上宋-14/宁优高。郑鑫等[41]研究了4种海棠与“绿宝”苹果的嫁接亲和性，结果表明亲和性较好的“绿宝”/圆叶海棠的净光合速率、气孔导度显著高于其他组合。

4 微嫁接鉴定

微嫁接是植物组织培养与嫁接技术的结合，利用微嫁接技术进行不同砧穗组合亲和性判定具有操作方便、周期短、占用空间少、见效快、结果可靠等优点，在嫁接亲和性的鉴定中被广泛应用[42]。胡梦珏等[43]通过愈伤组织离体靠接和试管苗劈接对“次郎”和“富有”嫁接在不同砧木上的亲和性进行比较，结果均显示以小果甜柿和牛眼柿为砧木时嫁接亲和性较好，这与各嫁接体的田间观测结果基本一致。陈莉[44]在日本甜柿“太秋”的砧木筛选研究中，通过观测愈伤组织和试管苗嫁接后接穗长势和嫁接口愈合程度来判断嫁接亲和性，结合田间嫁接试验结果，认为试管苗嫁接可以作为柿嫁接亲和性的早期判定方式。曹宝臣[45]利用离体嫁接技术比较了红地球接穗在不同砧木上的成活率和生物量指标，移栽后比较了不同嫁接组合的生理生化指标和光合生理指标，均得出亲和性强弱依次为红地球/贝达>红地球/双红和红地球/双优>红地球/LDP294。成密红等[46]研究了不同砧穗组合的樱桃微型嫁接苗成活情况，得出不同砧穗组合嫁接苗的亲和性由强到弱依次为Gisela-5/红鲁比、Gisela-5/红灯、Gisela-7/红鲁比、Gisela-7/红灯、ZY-1/红鲁比、ZY-1/红灯。丁明华等[47]对成年态南丰蜜橘试管茎尖微嫁接育苗技术进行研究，发现接穗与苦柚砧的亲和力显著高于枳壳砧和椪柑砧。程玉琴等[48]用试管微嫁接法鉴定苹果不同砧穗组合嫁接亲和性，通过观察解剖结构和移苗后的生长情况，发现试管微嫁接法适用于小金海棠、富士和新红星等苹果属植物的亲和性鉴定。

5 物理方法鉴定

对植物嫁接亲和性判断，生产上常用断裂实验法，即通过检测嫁接植株中抗张强度与嫁接后发育时间、发育状况的关系来预测嫁接的亲和性，但此法误差较大，无法在同一植株上进行连续测定[49]，学者们根据嫁接植株生理生化变化动态，结合物理技术进行探索研究。冯金玲等[50]研究了油茶芽苗砧嫁接愈合中电导率变化动态，发现植株死亡率与相对电导率呈显著正相关。曹泽文等[51]调查了“猩红”平滑山楂嫁接在不同砧木上的耐寒性，也间接地反映了亲和性强弱，结果表明亲和性较好的植株嫁接后相对电导率保持较低的水平。汪智军等[52]利用同位素32P示踪技术，比较了西伯利亚红松树与嫁接后的油松/西伯利亚红松营养的分配、吸收、运输情况，发现嫁接树的营养物质交换明显强于非嫁接树，是亲和性较强的组合，这与长期嫁接试验的记录相一致。钟启程等[53]用放射性32P和14C跟踪“糯米糍”荔枝与6种砧木嫁接后砧木和接穗之间营养物质的交换，发现在供试的6个荔枝嫁接组合中，由砧木输送到接穗的32P总量以“糯米糍/大造”较多，由接穗输送到砧木的同化产物亦以“糯米糍/大造”较多，与试验地区长期培育的荔枝嫁接苗表现相符。王元裕等[54]观察了多种砧木与16个甜柿品种嫁接组合的成活、生长状况，同时以14C进行营养物质运输的追踪研究，分析结果表明放射性活度的分配趋势与嫁接亲和力各项指标相关，特别与嫁接成活率和嫁接苗生长指数高度呈正相关。黄伯湛等[55]也认为可以用32P和14C示踪法进行荔枝不同砧穗组合的早期亲和性判定。

6 问题及展望

目前对果树嫁接亲和性的研究已经从形态学、解剖学和生理生化水平深入到基因组学、转录组学和蛋白组学水平，影响嫁接亲和的因素较多，这限制了嫁接在实际生产中的应用，明确一套有效的果树嫁接亲和性早期甄别、鉴定方法对产业发展具有重要意义。未来应从以下方面加强研究：

(1)不同的植物解剖结构、分子生物学和生理生化鉴定方面的研究试验结论统一度不高，难以形成有效的生产指导。一方面，需要建立系统的亲和性鉴定方法，加强实验材料的标准化，考虑砧穗的取材部位、年龄、营养条件等因素的影响，加强鉴定方法的标准化，细化和规范鉴定指标，筛选出有效的测定指标、测定部位、测定时间等。另一方面，植物机体运转包括分子、基因调控和生理生化活动是一个多因素统一协调的过程，不同的植物代谢活动可能有差异，在分析单一表达途径、信号传导途径和单一因素的影响时，要考虑不同植物的特殊性以及各因素、途径之间的交互作用对亲和性的影响。

(2)微嫁接在植物亲和性的鉴定中具有不可替代的优势，但限制因素也比较明显，微嫁接需要在组织培养条件下进行，目前对果树的组织培养大部分还处于起步阶段，特别是热带果树组织培养难度较大。扩展微嫁接鉴定的运用范围首先要拓展不同果树的组织培养研究，确定培养条件和各影响因素的控制，在愈伤组织的嫁接中，要确定愈伤组织的适合嫁接时间，以免造成鉴定结果与真实情况的偏差。另外，可以结合细胞嫁接和细胞间信号物质的传递进行嫁接亲和性鉴定研究。