斯皮诺素磷脂复合物的制备及表征

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(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134;2.天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134)

斯皮诺素(2‴-O-β-D-吡喃葡萄糖基当药素,SPI)是酸枣仁中含量最高的黄酮类成分[1-2],且是《中国药典》2010年版所规定的酸枣仁的活性成分,具有镇静催眠、抗氧化、抗抑郁等多种药理作用[3],其结构式如图1所示。黄酮类化合物极性强且相对分子质量较大,能被吸收入血的量很少;黄酮类化合物也可能以主动转运的方式被吸收,相关蛋白是其相应的转运载体,而载体蛋白大多是能量依赖的,同时又有饱和性,能够通过主动转运吸收的数量并不多[4]。研究表明斯皮诺素生物利用度较低,仅为2.2%[5],选择合适的剂型来提高SPI的生物利用度尤为必要。磷脂复合物(PLC)是某些药物和磷脂通过电荷迁移作用或分子间作用力形成的相对稳定的复合物。黄酮类化合物结构中负电性较高的部位,在一定条件下可与磷脂带正电荷的极性端发生相互作用,形成氢键或以分子间的疏水作用结合在一起形成磷脂复合物,且使得磷脂的两性作用不被破坏[6]。迄今为止,国内已有芒果苷、山楂叶总黄酮、芍药苷以及柿叶黄酮等中药成分制成磷脂复合物的相关报道[7-10],且磷脂复合物既可以增强水溶性药物的脂溶性也可以增强脂溶性药物的水溶性,从而增加药物在胃肠道中的吸收,提高其生物利用度和疗效。国外学者Bombardelli 等[11]在研究脂质体的时候偶然发现:天然黄酮类的化合物对磷脂有较强的亲和力,二者可结合形成具有一定结构的复合物,因此,结合斯皮诺素自身结构特点,将其制成斯皮诺素磷脂复合物(SPI-PLC),并对斯皮诺素磷脂复合物(SPI-PLC)的制备及工艺优化进行较为详尽的研究,用紫外、红外光谱表征复合物的形成,以期优化出制备复合率(CR)较高的SPI-PLC的工艺条件,为实现SPI-PLC的工业化生产、改善斯皮诺素的口服吸收性能和提高生物利用度等相关研究奠定基础。

图1 斯皮诺素化学结构式Fig.1 The chemical structural formula of spinosin

1 材料与方法

1.1材料与仪器

斯皮诺素 本实验室提取、分离纯化并采用紫外光谱、红外光谱和质谱等检测方法对其进行表征,纯度大于98%;大豆卵磷脂E200 上海艾韦特医药科技有限公司;无水乙醇、丙酮、三氯甲烷等试剂 均为分析纯;水 为去离子水。

EMS-2型加热定时磁力搅拌器 天津欧诺仪器仪表有限公司;UV-7504型单光束紫外-可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;NEXUS 670型傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司;Bettensize 纳米粒度仪 丹东百特仪器有限公司;KQ-500B型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;XSE105型1/100000电子分析天平 上海Mettler-Toledo仪器有限公司;V-700型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷冻干燥机 德国Marin Christ 公司;DH-101型电热恒温鼓风干燥箱 天津市中环实验电炉有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 斯皮诺素磷脂复合物的制备 按照所需比例精密称取一定量的斯皮诺素和磷脂,置于50 mL具塞烧瓶中,加入适量反应溶剂(无水乙醇、丙酮、氯仿),在一定的温度和搅拌速度下反应一段时间,50 r/min转速下旋转蒸发(无水乙醇:浴锅温度56 ℃,压力184 mbar;氯仿:浴锅温度58 ℃,压力492 mbar;丙酮:浴锅温度61 ℃,压力578 mbar),除去反应溶剂。向残余物中再次加入5 mL溶剂,充分溶解后减压抽滤,收集滤饼,即得粗斯皮诺素磷脂复合物。

1.2.2 制备工艺的质量评价 以SPI-PLC的复合率CR为指标来评价复合物的制备工艺。斯皮诺素水溶性较好,在水、甲醇、乙醇等溶剂中均可溶解,但不溶于氯仿。利用斯皮诺素在氯仿中不溶,而SPI-PLC溶于氯仿这一特性,向制备的粗产物中加入10 mL氯仿,充分溶解未结合的磷脂及形成的复合物,抽滤,收集滤液和沉淀。滤液经旋转蒸发后得磷脂复合物;沉淀于40 ℃烘箱下干燥,分析天平称重,得未与磷脂结合的斯皮诺素(W),斯皮诺素初始加药量(W0)与沉淀量(W)之差即为和磷脂结合的斯皮诺素的量,因而SPI-PLC的CR值计算公式如下:CR=(W0-W)/W0。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 反应溶剂的考察 设定SPI与磷脂的投料比为1∶15 (g/g),反应温度为40 ℃,反应时间为3 h,搅拌速度为800 r/min,以SPI-PLC的CR为评估标准,对无水乙醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮和四氢呋喃进行考察,优选出可以达到较高CR值的反应溶剂[12-14]。

1.2.3.2 反应温度的考察 一般来说,反应温度越高,反应速度越快,反应更加完全,但据文献报道磷脂及形成的磷脂复合物在高温环境下易被氧化和破坏[8],故本实验以丙酮为反应溶剂,考察反应温度为20、30、40、50、60 ℃对磷脂复合物复合率的影响,其余实验条件同“1.2.3.1”。

1.2.3.3 药脂比考察 固定反应温度为40 ℃,分别按质量比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的比例称取一定量的斯皮诺素与大豆磷脂,按“1.2.3.2”的实验条件制备磷脂复合物,测定复合物的CR值。

1.2.3.4 搅拌速度的考察 设定斯皮诺素与大豆磷脂质量比为1∶15,考察磁力搅拌速度为200、400、800、1200和1400 r/min时对复合物CR的影响,其余实验条件同“1.2.3.3”。

1.2.3.5 反应时间的考察 设定搅拌速度为800 r/min,其余实验条件同“1.2.3.4”,考察反应时间分别为1、2、3、4、5 h时对磷脂复合物复合率的影响。

1.2.4 Box-Behnken设计-响应面法优化SPI-PLC制备工艺 由单因素实验结果可知,药脂比、搅拌速度和反应时间对SPI-PLC的CR影响具有显著性,因此采用Box-Behnken设计如表1所示的3因素3水平的实验,以CR为评价指标,进行多元线性回归和二项式方程拟合。根据拟合方程的相关系数判断模型拟合程度是否良好,进而确定该模型是否可用。绘制效应指标CR与其中任意2个自变量的三维图,从而优化SPI-PLC的制备工艺,得到最佳工艺条件。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 斯皮诺素磷脂复合物的结构表征

1.2.5.1 紫外分光光度法 配制斯皮诺素、磷脂、物理混合物(斯皮诺素与磷脂按质量比1∶16.42混合)、SPI-PLC的无水乙醇溶液。以无水乙醇为空白,于200～400 nm波长区进行紫外扫描,记录紫外吸收图谱。

1.2.5.2 红外光谱分析 将磷脂、斯皮诺素、物理混合物(斯皮诺素与磷脂质量比1∶16.42混合)以及SPI-PLC分别与溴化钾混合压片。其中,上述各组分与溴化钾均以1∶200的比例于石英研钵中同一方向充分研匀,然后进行压片,用空白溴化钾窗片进行背景采集,得各组分红外吸收光谱图。

1.2.5.3 粒径和多分散指数分析 室温下,取斯皮诺素磷脂复合物20 mg,用3 mL 双蒸水混悬并涡旋10 min,得到半透明状胶体溶液,再用双蒸水稀释至溶液光子数在20～50 K范围内,超声5 min,置于纳米激光粒度仪中测定其平均粒径和多分散指数(PDI)。

1.2.5.4 表观油水分配系数的测定 精密称量斯皮诺素适量,经甲醇溶解并制备浓度为1 mg/mL的储备液,用正辛醇饱和的水溶液稀释成2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列浓度梯度,测定335 nm处的吸光度(A),以A对浓度C进行线性回归,得回归方程。采用摇瓶法测定SPI-PLC的表观油水分配系数,量取正辛醇饱和的水溶液5 mL于具塞离心管中,分别加入适量的斯皮诺素、斯皮诺素与磷脂物理混合物和SPI-PLC,37 ℃,100 r/min振摇24 h至溶解平衡(预实验表明平衡时间为24 h),静置取上清液2 mL置于5 mL于具塞离心管中,分别加入正辛醇2 mL,37 ℃,100 r/min振摇至溶解平衡,静置。分别取水相和正辛醇相,稀释适当倍数进行测定。水相和油相中的溶解度分别记为CW和CO,可由公式P=log(CO/CW)计算出表观油水分配系数(P)。

1.3数据处理

单因素实验相关数据运用SPSS软件进行方差分析和独立样本T-test,采用Design-Expert 8.0.7.1实验设计软件分析响应面实验结果。

2 结果与讨论

2.1单因素实验

单因素实验中各因素对磷脂复合物CR值影响如图2所示。

图2(a)结果表明,溶剂为无水乙醇、二氯甲烷和四氢呋喃时效果不佳,而在丙酮和氯仿中的CR值均较高且和其他三种试剂相比具有显著性差异,但由于氯仿毒性大,腐蚀性强,故本实验选用丙酮作为后续实验的反应溶剂。

图2(b)显示,反应温度为20、30、40、50和60 ℃时的CR值分别为 80.06%、81.57%、82.49%、80.37%和79.13%,且T-test表明三者之间无显著性差异,因此反应温度对复合物的CR影响较小,因此选用反应温度为40 ℃的条件进行后续实验。

图2(c)结果显示,药脂比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20时的复合率分别是48.01%、79.05%、84.63%、88.31% 和82.09%,且和最小值相比具有显著性差异(p<0.05),这表明在一定范围内,复合物的CR值随磷脂比例的升高而增大,但当药脂比为1∶20时,CR值有所降低,这可能是因为药物分子中能够与磷脂结合的位点已达到饱和。而药脂比1∶1时,CR值偏离其他结果较多,证明最优药脂比不在1∶1～1∶5范围内,因此在设计实验时不再考察1∶1～1∶5范围内的药脂比,而通过响应面实验对1∶10～1∶20这一范围进一步优化。

由图2(d)可知,搅拌速度对磷脂复合物的复合率影响较大,且搅拌速度为200、400、800、1200和1400 r/min时的CR值分别为71.17%、87.85%、93.92%、78.96%和70.05%,因此转速在400～1200 r/min的范围内效果较好。

图2(e)表明反应时间对复合物的CR值有一定影响,在1～3 h范围内,随时间的延长,CR值增大,随后CR值降低,但在2～4 h的范围的CR值较高,因此需通过响应面实验在2～4 h范围内优化反应时间。

2.2Box-Behnken设计-响应面法优化SPI-PLC制备工艺

图2 不同因素对复合物CR的影响(n=3)Fig.2 Effects of different factors on the CR of complex(n=3)

2.2.1 实验设计及结果 单因素结果表明,药脂比(A)、搅拌速度(B)、反应时间(C)是影响最为显著的三个因素,3因素3水平的Box-Behnken 实验安排及结果见表2。

表2 Box-Behnken 实验安排及结果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.2.2 二次回归方程的建立 使用Design-Expert 8.0.7.1软件对实验数据进行处理,多元线性回归和方程拟合结果表明,CR用二项式回归最优,其二次多元回归方程为CR=90.49+5.22A+0.93B+3.71C+2.33AB+2.44AC-1.30BC-10.67A2-6.74B2-8.05C2(R2=0.9955,p<0.0001)。

2.2.3 方差分析和显著性检验 二项式回归方程系数显著性检验的结果见表3。表3数据显示R2为0.9955,且回归模型极显著(p<0.0001),而失拟项(p=0.0593>0.05)是不显著的,故模型拟合度较好,可用来对斯皮诺素磷脂复合物的制备工艺进行初步分析和预测。回归方程中各因素的一次项A、C和二次项A2、B2、C2以及交互项AB、AC对SPI-PLC的复合率CR影响都是极显著的,一次项B和交互项BC是显著的,说明各因素对SPI-PLC的复合率CR都有非常大的影响。根据各因素F值的大小,可以看出3个因素对SPI-PLC复合率CR的影响大小依次是 A>C>B,即药脂比>反应时间>搅拌速度。

2.2.4 优选处方的预测与验证 利用Design-Expert 8.0.7.1实验设计软件绘制的效应指标CR与其中任意2个实验因素的三维效应曲面图如图3所示。

图3(a)显示,在反应时间C为3 h的条件下,药脂比A和搅拌速度B对SPI-PLC的CR值的影响。 SPI-PLC的CR随着B的增加先升高后降低,随着A的增加亦先升后降,交互影响显著。图3(b)显示,在B为800 r/min的条件下,A和C对SPI-PLC的CR值的影响。CR随着C和A的增加先升后降,交互影响显著。图3(c)显示,在A为1∶15的条件下,B和C对SPI-PLC的CR的影响,规律同上。

按各指标的期望设定目标,得到的优选处方条件是药脂比为1∶16.42,搅拌速度为836 r/min,反应时间为3.27 h。依据该处方制备3批SPI-PLC,测定各批CR值。实际测量CR为 90.75%±0.64%(n=3),模型对指标的预测值为91.77%。结果显示实测值与预测值之间没有显著性差异(相对误差=1.1%),表明该模型预测性良好,因此该制备处方切实可行。

2.3斯皮诺素磷脂复合物的结构表征

表3 二项式回归方程系数显著性检验Table 3 Significance of coefficients in second order regression equation

图3 各因素对响应值影响的三维效应曲面图Fig.3 3D Response surface plot for effects of each factor

注:*:p<0.05,显著;**:p<0.01,极限著。

2.3.1 紫外分光光度法 斯皮诺素、磷脂、物理混合物(斯皮诺素与磷脂按质量比1∶14.5混合)、SPI-PLC的无水乙醇溶液在200～400 nm波长区的紫外吸收图谱如图3所示。黄酮类化合物因分子中存在桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共轭体系,故在200～400 nm的区域内存在两个主要的吸收带,称为峰带Ⅰ(300～400 nm)及峰带Ⅱ(220～280 nm)。一般来说,黄酮类化合物带Ⅱ的峰位主要受A-环氧取代程度的影响,而黄酮母核的取代情况影响带Ⅰ的峰位,实验过程中,为了定量更加精确,通常选择带Ⅰ的峰值作为最大吸收波长。由图4可知,斯皮诺素的两个峰带分别为335 nm和275 nm,因此335 nm为SPI的最大吸收波长。磷脂在285 nm 处有最大吸收,其余波长处均无吸收,故磷脂对斯皮诺素的测定无干扰作用,可用于SPI-PLC的制备。从图中还可以看出,斯皮诺素物理混合物与新形成的磷脂复合物的紫外图谱形状均呈现出斯皮诺素的特征,都在335 nm 处有最大吸收峰。紫外图谱结果表明磷脂复合物中斯皮诺素发色团的结构并未发生改变,即反应后没有新的化合物的形成。

图4 磷脂、斯皮诺素、斯皮诺素磷脂物理混合物及SPI-PLC的紫外吸收光谱图Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of phospholipids(A),spinosin(B),physical mixture(C),and SPI-PLC(D)

2.3.2 红外光谱分析 磷脂、斯皮诺素、物理混合物(斯皮诺素与磷脂质量比1∶14.5混合)以及SPI-PLC的红外吸收光谱图如图5所示。从谱图中可看出,形成复合物后,斯皮诺素1716和1733 cm-1处的C=O的伸缩振动峰向高频区移动,移至1735 cm-1处,而且峰形也发生了一定变化,由双峰变成了单峰;1075 cm-1峰为与苯环相连的C=O伸缩振动峰,形成磷脂复合物后变为1053和1088 cm-1的双峰,而磷脂的1718 cm-1峰为C=O伸缩振动峰,向低频区移动,移至1651 cm-1。将物理混合物的吸收峰与复合物的吸收峰做对比,复合物在1239、1465 cm-1以及 874、722 cm-1出现新的吸收峰。结果表明形成的复合物并不是磷脂分子与斯皮诺素简单的物理混合。磷脂复合物可能是由分子间相互作用形成的,而这种相互作用是磷脂分子与斯皮诺素特定官能团能够紧密结合的原因。

图5 磷脂(A)、斯皮诺素(B)、斯皮诺素磷脂物理混合物(C)及SPI-PLC(D)的红外光谱图Fig.5 FTIR Patterns of phospholipids(A),spinosin(B),physical mixture(C),and SPI-PLC(D)

2.3.3 粒径和多分散指数分析 纳米激光粒度仪测得SPI-PLC的水分散体的平均粒径为(542.1±12.5) nm,PDI为0.167±0.024,见图6。游离斯皮诺素因其本身分子量较小,不能用纳米激光粒度仪测定粒径大小。而由于磷脂的双亲结构,在水中可以形成具有脂质双分子层的囊泡结构,当药物被包裹于其中就形成了通常的脂质体,故形成了具有一定粒径的磷脂复合物,且分散较为均匀,稳定性好。

图6 SPI-PLC的水分散体粒径图Fig.6 Diameter distribution of aqueous dispersion of SPI-PLC

2.3.4 表观油水分配系数的测定 实验所得标准曲线回归方程为A=0.0172 C-0.0346,R2=0.9999,结果表明斯皮诺素在2～100 μg/mL范围内线性关系良好,可用于斯皮诺素含量的计算。斯皮诺素、物理混合物和SPI-PLC在正辛醇-水系统中的表观分配系数如表4所示。结果表明SPI-PLC在水和正辛醇中的溶解度均大于原药及物理混合物,且形成磷脂复合物后表观油水分配系数P值也增大。一方面可能是其无定型的状态及在水中形成胶团的增溶作用使水溶性有所增加,另一方面则可能是由于药物极性基团与磷脂缔合,使药物极性基团受到屏蔽,表现出较强的脂溶性。从物理混合物的实验结果表明,磷脂的存在只是有限地改善了SPI在水中和正辛醇中的溶解性能。

表4 斯皮诺素、物理混合物和SPI-PLC在正辛醇-水系统中的表观分配系数(n=3)Table 4 Apparent partition coefficient of SPI,physical mixture,and SPI-PLC in octyl alcohol-water system(n=3)

3 结论

采用溶剂挥发法成功制备了SPI-PLC,并得出最优工艺条件。以丙酮作为反应溶剂,药脂比为1∶16.42,搅拌速度、反应温度和反应时间分别为836 r/min、40 ℃和3.27 h制备的SPI-PLC的复合率可达 90.75%±0.64%(n=3),且制备工艺操作简便。工艺验证实验表明,选择的工艺条件稳定,基本可行。UV、IR图谱表明SPI-PLC并不是磷脂分子与斯皮诺素简单的物理混合,而可能是分子间相互作用形成的。表观油水分配实验表明,形成的具有一定粒度的磷脂复合物既增加了斯皮诺素的水溶性,又增加了其脂溶性,因此预测可提高生物利用度。后期通过Caco-2细胞模型跨膜转运实验和生物利用度测定实验进一步研究SPI-PLC的膜渗透性和生物利用度的改善情况。

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