松墨天牛14-3-3ζ基因的鉴定及生物信息学分析

吴华俊，陈敬祥，林 同

（1.华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510640；2.佛山市云勇生态林养护中心，广东 佛山 528518）

松墨天牛（Monochamus alternatusHope）又名松褐天牛，属鞘翅目（Goleoptera）天牛科（Cerambycidae），是危害马尾松（Pinus massoniana）等松属（Pinus）树木的重要蛀干类害虫，也是我国重要的检疫性有害生物［1］。松墨天牛主要危害长势较弱或濒死木，通过啃食树干、枝条的韧皮部和木质部摄取养分，严重的甚至会导致松树死亡［2］。松墨天牛携带有大量的松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus），是松材线虫萎蔫病的主要传播媒介［3-4］。控制松墨天牛种群数量及活动范围是切断松材线虫自然传播途径的有效方法［5］，在新形势下必须通过害虫综合防治技术（IPM）防控松墨天牛，而探寻新的药物作用靶标，设计新型环保的昆虫行为调节剂已成为了松墨天牛综合防治的重要手段。

1967年，Moore等［6］在分离牛脑蛋白过程中首次发现了14-3-3蛋白，命名是根据该蛋白在纤维素柱层析中的片段数目以及在淀粉凝胶电泳中的迁移率而来。14-3-3蛋白是酸性蛋白，具有可溶性，广泛存在于真核生物的细胞中，是有高度保守性的蛋白家族［7］。真核生物物种中14-3-3蛋白由同一个基因家族来编码，动物、植物之间的同工型相似性高达70%以上，人（Homo sapiens）14-3-3 Zeta（ζ）蛋白和酵母（Saccharomyces）14-3-3蛋白的氨基酸序列的相似性也高达70%左右［8］。在哺乳动物中存在α～η等7个亚型，其中α是β的磷酸化形式、δ是ζ的磷酸化形式；昆虫如果蝇（Drosophila melanogaster）和家蚕（Bombyx mori）至少有2个亚型，植物如拟南芥（Arabidopsis thaliana）甚至存在十几个亚型［9-10］。Ichimura 等［11］首次对 14-3-3 蛋白家族的作用进行阐述，认为该蛋白可作为丝氨酸/酪氨酸羟化酶的激活因子。真核生物中超过200种靶蛋白能与14-3-3蛋白发生相互作用，参与了细胞几乎所有的重要生理过程，如新陈代谢，细胞周期、信号转导、酶活性调节等［12］。由于14-3-3蛋白具备功能上的多样性和在生物代谢过程中的重要性这两个特性，使得该蛋白有可能作为分子药物的靶标，影响或调控生物体的某些生命过程［13］。

目前关于14-3-3蛋白基因的研究集中在人类临床医学［14-15］，对家蚕、果蝇、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、柞蚕（Antheraea pernyi）、桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）等昆虫也有研究［10，16-19］，但对于鞘翅目昆虫未见报道。本研究从已经构建的松墨天牛cDNA文库中筛选出含有14-3-3蛋白基因开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）的序列，通过Blast同源比对，鉴定为松墨天牛14-3-3ζ基因，并进行该蛋白基因的生物信息学分析，初步探究14-3-3蛋白在松墨天牛发育代谢过程中的作用，为进一步研究其作用机理、表达功能和设计以14-3-3蛋白为靶标的昆虫行为调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

松墨天牛幼虫是从广州从化区的一处马尾松次生林采集而来，通过配置人工饲料的方式饲养至成虫［20］：每只虫单独装在50mL的塑料离心管中，置于人工气候培养箱内，饲养温度为25～28℃，相对湿度为65%～75%，黑暗环境下生长。

1.2 序列测定及鉴定

松墨天牛cDNA文库由华南农业大学林学与风景园林学院昆虫分子生物学实验室构建，其具体方法参照文献 ［21］。对松墨天牛cDNA文库的阳性克隆随机测序获得表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST），通过筛选文库中的EST，并与GenBank数据库进行Blast比对，得到一条与昆虫14-3-3 Zeta（ζ）同源的基因序列，该序列有完整的ORF。

1.3 生物信息学分析

运用生物信息学软件对该基因蛋白序列进行生物信息学分析（表1）。

1.4 系统发育树构建

在NCBI （http：//www.Ncbi.nlm.Nih.gov/）GenBank数据库中检索昆虫14-3-3ζ氨基酸序列，用DNAMAN软件进行同源性比对；用MEGA 5.0软件构建系统发育树（NJ法），系统发育树每个分支的统计学显著性分析用bootstrap进行检测，重复次数为1000次。

2 结果与分析

2.1 基因序列

通过在基因文库中筛选和同源性比对，所克隆的基因鉴定为松墨天牛14-3-3ζ基因，命名为Ma14-3-3ζ，cDNA全长为902 bp，其中包含15 bp 的5′端非编码区以及140 bp的 3′端非编码区，ORF从16～762 bp共747 bp，编码248个氨基酸，推测的编码蛋白分子量为28.16 ku，等电点为 4.73。Ma14-3-3ζ的核苷酸序列及推导的氨基酸序列见图1。

表1 生物信息学分析软件及其功能

2.2 生物信息学分析

图1 Ma14-3-3ζ基因全长及推导的氨基酸序列

Ma14-3-3ζ二级结构包含了α-螺旋、β折叠和卷曲3种结构（图2）。在蛋白质C末端和N末端各含有5个氨基酸位和16个氨基酸位的不规则卷曲，在该氨基酸中还含有2段β-折叠，分别占据8个氨基酸位和5个氨基酸位。在Ma14-3-3ζ二级结构中α-螺旋占68.15%，β-折叠占5.24%，卷曲占26.61%。 Ma14-3-3ζ疏水性分析结果显示为亲水性蛋白。TMHMM软件分析表明该蛋白为膜外蛋白，不存在跨膜区域。SignalP 分析没有显示该蛋白具有信号肽。卷曲螺旋是一种简单的蛋白质三级结构，它是由2 股或以上的α-螺旋相互缠绕形成的超二级结构，控制着蛋白质寡聚化。通过COILS Server预测发现Ma14-3-3ζ一共有8个卷曲螺旋。通过SMART分析，结果表明：松墨天牛14-3-3ζ基因编码蛋白有一个功能结构域，即14-3-3蛋白。

图2 Ma14-3-3ζ的预测二级结构示意图

2.3 同源性比对及系统发育树

图3 Ma14-3-3ζ与其他12种昆虫14-3-3ζ基因氨基酸序列比对

用DNAMAN软件进行Ma14-3-3ζ与大黄粉虫（Tenebrio molitor）等12种昆虫的14-3-3ζ氨基酸序列同源性比对（图3）。Ma14-3-3ζ与12 种昆虫14-3-3ζ同源性为98%～90%，其中与大黄粉虫（Tenebrio molitor）的同源性达到了98%；与褐飞虱（Nilaparvata lugens）、芜菁叶蜂（Athalia rosae）同源性为95%；与欧洲熊蜂（Bombus terrestris）同源性为94%；与阿根廷蚁（Linepithema humile）、玉带凤蝶 （Papiliopolytes）、佛罗里达弓背蚁（Camponotus floridanus）、棉铃虫、家蚕等5种昆虫同源性为93%；与黑森瘿蚊（Mayetiola destructor）、黑小按蚊（Anopheles atroparvus）、地中海实蝇（Ceratitis capitata）等3种昆虫同源性为91%～90%。

由MEGA5.0软件构建的基于13种昆虫14-3-3ζ的系统发育树表明：松墨天牛与大黄粉虫遗传距离最近，在同一分枝上；与黑小按蚊等遗传距离较远（图4）。这些结果与序列同源性比对的结果相一致。

3 结论与讨论

随着基因组和功能基因组研究的迅猛发展，生物信息学的理论和方法也取得很大进步，基于生物学实验数据和现代计算技术相结合的生物信息学分析技术，在昆虫学研究领域得到了广泛应用［22］。本研究旨在从生物信息学角度初步研究松墨天牛表达的蛋白质所具有的理化特性，为今后开展松墨天牛14-3-3ζ基因的功能提供理论基础。

14-3-3蛋白具有高度保守性，是目前发现参与生命代谢途径最多的蛋白之一，也是在临床医学、基础医学、生物学等领域研究得比较多的蛋白之一［23-26］。14-3-3蛋白分子量在28～33 ku之间，等电点PI在4～5之间，无跨膜片段序列，能以同源/异源二聚体的形式与多种功能蛋白相互作用［27］。本研究通过对Ma14-3-3ζ的生物信息学软件分析发现，其编码蛋白含有248个氨基酸残基，蛋白分子量为28.16 ku，等电点PI为4.73，与前人所研究的14-3-3蛋白家族个体特征相吻合。而且Ma14-3-3ζ属于膜外蛋白，不存在跨膜区域，通过同源比对可以发现，Ma14-3-3ζ与12种昆虫14-3-3ζ蛋白同源性高达90%以上，如此高的序列同源性也进一步印证了14-3-3蛋白在结构和进化上的高度保守。

Shandala等［28］发现果蝇 14-3-3ε 蛋白在果蝇先天性免疫以及抗菌肽的分泌中起着关键的作用；当有外源物质进入果蝇和斑马鱼（Danio rerio）体内时，14-3-3ζ蛋白可以调节丝切蛋白将异源物质吞噬，从而提高了其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）侵染的抵抗力，同样家蚕中该蛋白的存在亦可增强家蚕对病毒的敏感性［29-30］。黄麟等［31］进行了松材线虫和拟松材线虫（B. mucronatus）14-3-3蛋白基因全长cDNA克隆与分析，发现两者编码氨基酸序列完全相同，并与植物线虫南方根结线虫（Meloidogyne incognita）系统发育关系上最为亲近。申建梅等［19］克隆了桔小实蝇14-3-3基因，通过实时荧光定量PCR分析发现该蛋白在桔小实蝇的不同组织不同发育时期均有表达，并推测可能在桔小实蝇蛹发育过程中发挥重要作用。

松墨天牛是林业重大害虫，其整个生命周期需要经过卵、幼虫、蛹、成虫这4次完全变态才能完成，该生命周期过程受到了大量细胞间信号转导的精确调控。14-3-3蛋白是目前发现参与代谢途径、细胞周期调控、细胞凋亡、离子通道等生命过程最多的蛋白之一，因此对松墨天牛14-3-3蛋白的研究不仅有助于更好地阐明松墨天牛的生长发育过程和生物机制，而且可以为新型昆虫调节剂的研发提供理论依据。所以下一步研究重点将要探究Ma14-3-3ζ在松墨天牛体内不同组织部位和发育阶段的表达情况，以及在外源病毒入侵时该蛋白表达情况会发生怎样的变化。这些都将有待利用RNA干扰、荧光定量表达等技术进行更深入的研究。

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