赤皮青冈离体花枝培养及花粉活力研究

吴水平，李 琳，王利宝

赤皮青冈（Cyclobalanopsis gilva (Blume)Oerst）又名红绸，属壳斗科青冈栎属植物，主要分布在我国南部湖南、福建、贵州和浙江等省，其生长较快、分布广、适应性强，心材暗红褐色，木材坚硬且有弹性，是历史上有名的珍贵材树种［1］。加强赤皮青冈良种培育是壮大珍贵用材树种产业和扩大珍贵材资源的主要环节。通过控制授粉开展良种选育是获得植物优良品系的重要途径，对于高大的乔木树种通过花枝室内培养获取花粉对于其人工授粉至关重要［1］。目前有关赤皮青冈的研究主要集中在分类、地理分布、种子生理、无性繁殖、群落特征、种群更新、播种育苗、水分胁迫等领域［2-10］，有关其花枝离体培养及花粉活力的研究几乎没有报道。该方面的研究可解决异地授粉和花期不遇的问题，也为通过人工控制授粉选育良种奠定基础。本研究可为开展赤皮青冈人工控制授粉、选育优良新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

花枝取自中南林业科技大学植物园仅存的 1 株母树。母树高 20 m，胸径 18 cm，平均冠幅 5 m，枝繁叶茂，生长旺盛。该树种在湖南长沙地区自然散粉时间是 4 月上旬，清明节前后 3～4 天是散粉集中期。

1.2 方法

1.2.1 花枝室内培养 以自然条件下树上花粉集中散粉时间为基准，分别提前 15、10、5 天，利用高枝剪截取待散粉的花枝进行室内花枝培养。培养溶液为 0.5% 的蔗糖液和多元素营养液（尿素 2.5 g/L，氯化钾 2.5 g/L，过磷酸钙 1.5 g/L）（在文献［10］基础上略作修改而得），并以自来水作为对照。培养期间，每隔 2 天更换 1 次新鲜培养液，培养液加入量以浸没花枝下端 10 cm 为宜，每天观察叶（尤其是嫩叶）、花序及花苞生长发育和散粉状况。

1.2.2 花粉收集

（1）室内培养的花枝花粉收集。待花苞开裂后将花序剪下，在干净的纸上轻弹花序，花粉即可散出。

（2）野外自然散粉母树花粉收集。于上午9 : 00 前采集母树上即将要散粉的花穗装入硫酸纸袋中，放在 25～30 ℃ 室内阴干，待次日花药大量爆裂之后，用手指轻弹花序，花粉即可散出。

（3）将收集的花粉装入加有干燥硅胶的棕色玻璃瓶中，盖上盖，室温下贮藏待用。

1.2.3 花粉活力测定 采用氯代三苯基四氮唑（简称红四氮唑，即 TTC）染色法测定花粉活力［11-12］。在 10 ml 蒸馏水中加 0.5 g TTC，待完全溶解后定容至 100 ml；将配好的染色液贮存在棕色瓶中待用。用洁净的毛笔分别粘取经 0、5、10、15 天贮藏的花粉置于具凹槽载玻片上，滴加 1 滴配制好的 TTC 染液，盖好盖玻片后放置在 35 ℃ 培养箱中，30 min 后取出于显微镜下观察染色结果。每个载玻片均观察 3 个视野，被染成红色的为活力较强的花粉粒，呈棕褐色的为发育不良的花粉粒，无色的为死亡的花粉粒。

1.2.4 花粉萌发 对野外采集的新鲜花粉和室内培养获得的花粉不经储藏测定其花粉在琼脂固态培养基上的萌发状况。分别采取单因素试验，在琼脂培养基中加入蔗糖，设 3 种处理浓度，分别是 50、100、150 g/L；在琼脂培养基中加入硼酸，设 3 种处理，分别是 100、300、500 mg/L。在最适蔗糖和硼酸浓度的培养基上［13］，于 3 种培养温度（22、25、28 ℃），下培育花粉。在培养 2、4、6、8、10、12、24 h 后分别通过显微镜（20 倍）观察培养的花粉，每个培养皿观察 3 个视野，取平均值。萌发的花粉其花粉管长度超过 1 倍花粉粒长度为萌芽依据。花粉管长度计数单位：1D＝1 倍的花粉粒长度。

1.2.5 数据统计与分析 观察统计每个视野花粉萌发率、花粉管长度、染色花粉粒数；使用 Excel、SPSS19.0 软件对数据进行处理和方差分析，并以最小显著差数法（LSD）进行多重比较分析。花粉活力与花粉萌发率计算公式如下：

花粉活力（%）＝平均每个视野染色的花粉数÷平均每视野花粉总数×100；

花粉萌发率（%）＝平均每视野萌发的花粉数÷平均每视野花粉总数×100。

2 结果与分析

2.1 培养液对不同离体时间的花枝散粉的影响

观察结果（表 1 仅列出部分结果）表明：室内条件下用 0.5% 的蔗糖溶液培养比野外自然散粉提早 15 天采集的离体赤皮青冈花枝，培养 13 天以上才能收集到花粉，虽然在培养 12 天后叶稍有萎蔫且嫩叶早于老叶萎蔫，但并未影响花粉囊的开裂和散粉；用自来水（对照）培养的第 4 天开始枯萎，第 6 天枯死，花粉囊未开裂；用多元素营养液培养的在第 9 天开始枯死，花序萎缩，花粉囊不能开裂，无花粉散出。培养比野外提前 10 天采集的离体花枝，则蔗糖溶液和多元素营养液培养的均可收集到花粉，蔗糖溶液培养的离体花枝叶色较多元素营养液培养的深，叶缘较舒展；自来水培养的离体花枝叶片提早萎蔫，花序干枯紧闭，未能收集到花粉。培养比野外提前 5 天采集的离体花枝，3 种培养液均可收集到花粉，且 3 种培养液培养的花枝形态上差异不大。

表1 培养液对离体时间不同的赤皮青冈花枝散粉的影响Tab.1 The effects on the dispersing pollens of Cylobalanopsis gilv of nutrition in different isolated time

2.2 贮藏时间对赤皮青冈花粉活力的影响

从表 2 看出：野外自然散粉获得的花粉和离体枝室内培养获得的花粉，于室温贮藏时间在 5 天之内，花粉活力都达 90% 及以上；保存 10天的花粉活力均低于 50%，但离体花枝培养获得的花粉活力明显高于野外自然散粉获得的花粉活力；保存 15 天，自然散粉花粉和离体花枝培养获得的花粉均无活力。在保存 0～5 天，离体花枝培养对花粉活力无显著影响，保存时间在 5～10 天，离体花枝获得的花粉较自然散粉的花粉耐储藏。室温下保存赤皮青冈花粉不宜超过 15 天。

表2 2种途径获得的花粉不同贮藏时间的活力Tab.2 The pollen vigour in different store time by 2 kinds of collection(%)

2.3 培养温度对赤皮青冈花粉离体萌发的影响

从表 3 看出：花粉在 25 ℃ 下培养，其花粉平均萌发率最高，为 74.0%；花粉管平均长度较长，为 5.1 D。在 22 ℃ 和 28 ℃ 下培养，不利于花粉萌发。可见，赤皮青冈花粉萌发的最适温度是 25 ℃。

表3 赤皮青冈离体花粉在不同温度下的萌发状况Tab.3 The germination status of pollen of isolated branch of Cylobalanopsis gilv in different temperature

2.4 蔗糖浓度对赤皮青冈花粉萌发的影响

从表 4 看出：花粉在添加 100 g/L 蔗糖的培养基中培养，其花粉平均萌发率最高，为 79.2%；花粉管平均长度最长，为 3.5 D。在添加 50 g/L 和150 g/L 的蔗糖培养基中培养，不利于花粉萌发。可见，赤皮青冈花粉萌发培养基的最适蔗糖浓度是 100 g/L。

表4 花粉在不同蔗糖浓度下的萌发状况Tab.4 Germination status of pollen at different sucrose concentrations

2.5 硼酸浓度对赤皮青冈花粉萌发的影响

从表 5 看出，花粉在添加 300 mg/L 硼酸的培养基中培养，其花粉平均萌发率最高，为 68.0%；花粉管平均长度最长，为 4.6 D。在添加 100 mg/L和 500 mg/L 的培养基中培养均不利于花粉萌发。可见，赤皮青冈花粉萌发培养基的最适硼酸浓度是 300 mg/L。

表5 赤皮青冈离体花粉在不同硼酸浓度下的萌发状况Tab.5 Germination status of pollen of isolated branch of Cylobalanopsis gilv in different boric acid concentration

2.6 不同因素对赤皮青冈花粉萌发率以及花粉管长度影响的差异

从表 6 看出：赤皮青冈花粉萌发过程中，培养基中蔗糖浓度是影响花粉萌发率最重要的因素，其次是培养温度，最后是培养基中硼酸浓度；对于花粉管生长来说，培养温度是最重要的影响因素，培养基中硼酸浓度其次，最后是培养基中蔗糖浓度。

表6 不同因素对赤皮青冈花粉萌发率和花粉管长度的影响Tab.6 The correlation analysis between factors of germination culture of pollen of Cylobalanopsis gilv

3 结论与讨论

室内离体培养比自然散粉前 15 天采集的赤皮青冈花枝，通过 0.5% 的蔗糖溶液培养 13 天获得的花粉与自然散粉的花粉萌发率和花粉活力差异不显著，用添加 N、P、K 的营养液和自来水培养均不能获得花粉。提前 10 天采集的待散粉花枝，用 0.5% 的蔗糖溶液和添加 N、P、K 的营养液培养均可获得花粉；提前 5 天采集的待散粉花枝，用蔗糖、添加 N、P、K 的营养液和自来水培养均可获得花粉。贮藏 5 天后，离体花枝培养获得的花粉和自然散粉获得的花粉的活力均达 90% 及以上；贮藏 10 天后，两种途径获得的花粉的活力均低于 50%，但离体花枝培养获得的花粉较自然散粉获得的花粉更耐贮藏；贮藏 15 天后，两种途径获得的花粉均无活力。赤皮青冈花粉室温贮藏时间不能超过 2 周。据孙超等［14］报道，采取低温贮藏花粉可以延长贮藏时间，低温贮藏赤皮青冈花粉待进一步研究。

促进赤皮青冈花粉萌发和花粉管生长的培养基的最适蔗糖浓度是 100 g/L，最适硼酸浓度是 300 mg/L，最适温度是 25 ℃；蔗糖浓度对于花粉萌发最重要，其次是温度，最后是硼酸浓度；温度对花粉管伸长最重要，其次是硼酸浓度，蔗糖浓度对花粉管生长的影响最小。不同植物花粉萌发需要的蔗糖和硼酸浓度不同，但蔗糖和硼酸浓度是室内花粉萌发的基本条件［15-16］，培养温度一般在 25 ℃。培养赤皮青冈离体花枝获得的花粉，其授粉效果如何，还待作进一步研究。

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