丙泊酚注射液的溶血、过敏及刺激试验

王莉芳 李晓春

（陕西省食品药品监督检验研究院 陕西 西安 710065）

丙泊酚注射液是临床静脉全麻诱导药、“全静脉麻醉”的组成部分或麻醉辅助药。本品通过激活GABA受体—氯离子复合物，发挥镇静催眠作用。临床剂量时，丙泊酚增加氯离子传导，大剂量时使GABA受体脱敏感，从而抑制中枢神经系统，产生镇静、催眠效应。起效快，作用时间短，以2.5mg/kg静脉注射时，起效时间为30～60秒，维持时间约10分钟左右，苏醒迅速。有病例使用丙泊酚注射液后发生过敏反应，包括Quincke氏水肿，支气管痉挛、红斑和低血压，可引起局部注射部位疼痛，极少发生血栓和静脉炎，个别病例药物漏入静脉外时，可能出现严重组织反应。本文对其溶血、过敏及刺激性进行研究。

1.材料

1.1 药物与试剂

丙泊酚注射液（Ⅱ）（规格：10ml∶100mg），按供试品说明书中规定的临床最大人用量进行给药，剂量为2.5mg/kg。供试品原液浓度为10mg/ml，注射剂量0.25ml/kg，相当于临床人用最高剂量。

1.2 仪器

电子天平，德国塞多利斯公司，型号：BS2202S，分度值10mg。

1.3 实验动物

新西兰兔（雌雄兼用）；体重：2.2～2.4kg；豚鼠：（雌雄各半）；体重：300～350g，均由西安沣渭新区实验动物养殖场提供。实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2012-002；饲料：家兔全价颗粒饲料，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，生产许可证号：SCXK（陕）2014-004。

1.4 实验环境

普通级实验室，室温20～25℃，相对湿度40%～55%，每小时换新风15次。实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2013-001。

2.方法

2.1 刺激试验[2-4]

新西兰兔8只，按体重、性别随机分为2组，即供试品原液组和供试品稀释液组：按供试品说明书中规定的临床最大用量进行给药[1]，剂量为2.5mg/kg。供试品原液浓度为10mg/ml，注射剂量0.25ml/kg，相当于临床人用最高剂量，4只分别于左侧耳缘静脉以无菌操作方法静脉注射剂量为2.5mg/kg，于右侧等速等体积静脉注射5%葡萄糖注射液。供试品稀释液组：4只分别于左侧耳缘静脉以无菌操作方法静脉注射用5%葡萄糖注射液1∶2稀释的丙泊酚注射液（Ⅱ）。给药剂量仍为临床最大剂量2.5mg/kg，注射剂量0.76ml/kg。两组家兔分别于右侧等速等体积静脉注射5%葡萄糖注射液。每天给药一次，连续给药5天。每次给药后观察血管及其周围组织的变化情况，末次给药后24h、48h、72h，及恢复期14天，病理组织学检查：于72h处死1号、2号、3号家兔，分别于左右耳缘静脉注射出，各取1cm长一段静脉血管连同周围组织，用10%的甲醛固定48h，脱水、透明、包埋，3um切片。观察有无血栓形成、内皮损伤及炎症变化。可逆性症状观察及病理组织学取样4号1只家兔，末次给药观察72h后，每天进行一般情况观察和给药部位血管刺激性症状观察1次，连续观察14天，观察结束后同前述方法进行病理组织学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。病理学检查结果：光学显微镜下观察，兔耳给药静脉与对照静脉血管均规则完整，血管壁无增厚，内皮细胞排列整齐，无血栓形成，血管周围无明显炎症反应及其他病理变化。

图1 病理学检查光学显微镜图

2.2 溶血与凝聚试验

取兔血约20毫升，放入烧杯中，用玻璃棒轻搅10分钟，除去纤维蛋白原，使之成为脱纤血液。加约10倍量的0.9%氯化钠注射液，摇匀、离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠注射液同法洗涤3次，至上清液不呈红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠注射液稀释成2%的混悬液，供实验当天使用，用时摇匀。

本品说明书中相关内容：本品是一种起效迅速（30s）、短效的全身麻醉剂药。未经稀释的本品注射液可直接用于输注，也可稀释后使用，但稀释也只能是5%葡萄糖注射液。故选用供试品原液组和供试品稀释液组。稀释液组采用5%葡萄糖注射液1∶2稀释，本试验分两组为供试品原液组和供试品稀释液组。进行溶血与凝聚试验。

表1 供试品原液组溶血与凝聚试验结果

表2 供试品稀释液组溶血与凝聚试验结果

图2 原液组各管至恒温箱温育180min拍照（试管标号1至5分别对应0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml供试品原液体积试样，标号6和7分别对应0.9%NaCl阴性组和蒸馏水阳性组）。

图3 1∶2稀释液组各管至恒温箱温育180min拍照（试管标号1至5分别对应0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml供试品稀释液体积试样，标号6和7分别对应0.9%NaCl阴性组和蒸馏水阳性组试样）。

2.3 豚鼠主动全身过敏试验

本品说明书中相关内容：本品是一种起效迅速（30s）、短效的全身麻醉剂药。未经稀释的本品注射液可直接用于输注，也可稀释后使用，但稀释也只能是5%葡萄糖注射液。大多数年龄小于55岁成年人给药量按体重约为2.0～2.5mg/kg。2014年《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，本研究采用供试品浓度分别为3.5mg/ml，1.75mg/ml，1.4mg/ml。设高、中、低三个剂量组。高剂量组每只豚鼠腹腔注射给予供试品5mg/ kg，3.5mg/ml，相当于临床人用最高剂量的2倍进行致敏；中剂量组每只豚鼠腹腔注射给予供试品2.5mg/kg，1.75mg/ml进行致敏，相当于临床人用最高剂量；低剂量组每只豚鼠腹腔注射给予供试品2.0mg/kg，1.4mg/ml进行致敏，相当于临床人用低剂量。每只豚鼠腹腔注射均给予0.5ml/只。先进行预实验，如出现过敏反应，则逐步递减给药剂量。②阳性对照组：每只豚鼠腹腔注射给予1.0%新鲜鸡蛋清0.5ml/只进行致敏。③阴性对照品组：每只豚鼠腹腔注射给予5%葡萄糖注射液0.5ml/只进行致敏。于第1、3、5天各致敏1次，共致敏3次。以致敏剂量的2倍进行激发各受试物每组首次致敏注射后第14天、第21天分别快速静脉注射致敏剂量的2倍进行激发。

表3 被动皮肤过敏试验制备抗体血清时对豚鼠体重的影响（±s，n=6）

表3 被动皮肤过敏试验制备抗体血清时对豚鼠体重的影响（±s，n=6）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05.

组别 体重（g）致敏前 末次致敏 采血阴性对照 262.17±18.51 325.17±18.91 346.33±25.66阳性对照 299.50±29.90 295.33±22.24 293.50±17.31*低剂量组 287.83±32.96 337.83±9.75 329.83±36.58高剂量组 272.83±35.75 316.00±11.30 332.83±17.53

表4 蓝斑直径统计数据（±sD，n=6）

表4 蓝斑直径统计数据（±sD，n=6）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.

组 别注射部位蓝斑直径（mm）A B C D E F阴性对照组 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0阳性对照组 18.88±4.72** 16.75±4.19** 15.37±3.84** 14.13±3.53** 14.67±3.66** 13.60±3.40**低剂量组 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0高剂量组 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

取体重300～400g健康豚鼠24只，分为四组，第一组为阳性对照组，注射1.0%新鲜鸡蛋清0.5ml/只；第二组为阴性对照组，注射5%葡萄糖注射液0.5ml/只；第三组为供试品高剂量组供试品浓度为1.75mg/ml，相当于临床最高量；第四组为供试品低剂量组，供试品浓度分别为1.4mg/ml相当于临床低剂量；连续3次，分别隔日腹腔注射，于首次注射后14天、21天静脉注射各组对应的供试液2倍量进行激发。激发后30min连续观察可见，1%新鲜鸡蛋清阳性对照组豚鼠激发后即刻出现喷嚏、咳嗽、排尿、痉挛、步态不稳等明显反应，6只豚鼠均在激发后5min内死亡，按全身致敏性评价标准评判为“20”，属极强阳性。丙泊酚注射液（Ⅱ）低、高剂量组豚鼠激发后即刻出现10～15min的昏迷，但苏醒后一般状况良好，无明显过敏反应。5%葡萄糖注射液阴性对照组豚鼠激发后一般状态良好，未见明显过敏反应症状，供试品组豚鼠和阴性对照组豚鼠比较除供试品组豚鼠出现昏迷（本品为麻醉药）外未见明显差异，按全身致敏性评价标准评判为“0”，过敏反应为阴性。试验期间豚鼠体重增长良好，供试品组与阴性对照组比较未见明显异常。未引起豚鼠的过敏性反应。

2.4 豚鼠被动皮肤过敏试验

分别给予豚鼠丙泊酚注射液（Ⅱ），浓度分别为1.75mg/ ml，1.4mg/ml。隔日1次，连续5次给豚鼠腹腔注射0.5ml/只致敏，末次致敏后第14天心脏采血，分离血清，并用原液和5%葡萄糖注射液稀释成 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32六种稀释度，给正常豚鼠背部皮内注射，4小时后静脉注射掺入伊文思蓝的供试液，30分钟后测量注射部位皮肤内层蓝斑直径。

2.4.1抗血清的制备 取豚鼠24只，雌雄各半，体重250～350g。按体重随机分为4组，即供试品高剂量组、供试品低剂量组、阴性对照组、阳性对照组，每组6只。每组动物分别腹腔注射0.5ml/只，隔日1次，共5次。末次致敏后14d，心脏采血，2000r/min离心10min，分离血清2周内备用，-20℃保存。

2.4.2被动致敏 采用皮内注射，给药量为0.1ml/点。先将豚鼠固定，背部朝上，用电推剪进行脱毛，大小约8×6cm2，脱毛后每侧取3个注射点，每个点之间间隔约2.5cm。将各组抗体血清分别用5%葡萄糖注射液稀释成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，用上述稀释液进行皮内注射。经预试验，激发时间在被动致敏4小时后为宜，采用足静脉注射，给药1次，给药量为1ml/只，注射供试品各组或和对照品各组0.5ml加0.5ml0.8%伊文思兰染液。激发30min后断头处死各组动物，剪取背部皮肤，用游标卡尺测量皮肤内层的蓝色斑点的大小。以蓝斑直径作为评价，直径大于5mm者判定为阳性，不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半[5]。

提供各项实测的具体数据，豚鼠体重、蓝斑直径属于计量资料并符合正态分布，采用SPSS 13.0单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计。

2.5 数据处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验数据均以（±s）表示，用ANOVA进行统计学检验，P＜0.05视为差异有统计学意义。

3.讨论

丙泊酚的药理作用已有广泛的研究报道，但对其安全性的研究还很少，加上近几年麻醉意外增多，丙泊酚新剂型的开发方兴未艾。大豆油做赋形剂1%和2%传统丙泊酚乳剂是目前最常用的剂型。因此剂型支持细菌生长，所以在常规剂型中加入了EDTA(已二胺四醋酸)或亚硫酸盐作为抗菌成份。目前抗菌成分的选择仍存在争议。因为EDTA和亚硫酸盐可以引起过敏反应，尤其对特发行哮喘病人。应用含有EDTA或亚硫酸盐的丙泊酚在年龄≥40、长期吸烟患者可导致全肺阻力增加，但肺泡充盈压力变化不明显。结果提示亚硫酸盐对气道高反应性患者可至气管支气管平滑肌收缩引起肺血管阻力增加。亚硫酸盐可促进大豆油脂肪乳剂的脂酯过氧化反应，注射过程中可使丙泊酚注射液变成浅黄色。另外还可以降低丙泊酚乳剂的pH值，使丙泊酚乳剂“水包油”结构不稳定，增加丙泊酚乳剂分子数量和直径增加。丙泊酚乳剂是否加入抗菌添加剂目前仍有争议。欧洲国家临床应用的是无任何抗菌添加剂的丙泊酚乳剂。如果在丙泊酚配置过程中能严格无菌操作、对开瓶抽取后的丙泊酚正确保存，细菌污染将减少到最低限。有作者建议，对伴有呼吸功能衰竭、需长时间镇静的危重病人，抗菌配方乳剂仍是较好选择。

所以，有必要进行丙泊酚注射液的溶血、过敏和刺激反应的研究。丙泊酚注射液在本实验条件下,在临床拟用浓度（2.5mg/ kg）下，体外没有溶血作用和凝聚反应。豚鼠注射临床浓度（1.75mg/ml）丙泊酚注射液后，不引起豚鼠全身过敏反应。丙泊酚注射液1.75mg/ml、1.4mg/ml，对豚鼠均无被动皮肤过敏反应。在临床拟用浓度（2.5mg/kg）原液下，丙泊酚注射液对兔耳血管均无刺激作用。

[1]化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则.北京:国家食品药品监督管理局药品审评中心,2014.

[2]袁伯俊,廖明阳,李波.药物毒理学实验方法与技术[M].北京:化学工业出版社.2007:255-256.

[3]朱玉云，高允生，成立军等.利巴韦林葡萄糖注射液的安全性评价[J]. 泰山医学院学报,1999,20(3):199-201.

[4]李学兰,姜隆梅,张红等.乳糖酸红霉素药物浓度和给药次数对血管刺激性的影响[J].泰山医学院学报,2002,23(3):227-228.

[5]国家食品药品监督管理局.中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光过敏反应)研究的技术指导原则[M].北京:中国医药科技出版社,2005.