外泌体与胃癌关系的研究进展

孙蓓丽 王玉刚

上海交通大学医学院附属同仁医院消化内科(200336)

胃癌是常见恶性肿瘤之一，严重危害居民健康和增加政府财政负担。2012年中国胃癌新发病例数和男性发病率位居同期恶性肿瘤第2位，死亡率位居第3位；女性胃癌发病率位居同期恶性肿瘤第4位，死亡率位居第2位[1]。胃癌预后与分期相关，然而目前早期胃癌诊断率低，大部分胃癌在确诊时已是进展期，预后不良。因此，早诊断、早治疗是提高胃癌患者生存率的重要手段。目前胃镜检查是诊断胃癌的金标准，但因其属侵入性检查、费用较高等缺点，难以用于我国胃癌的大规模筛查。亟待探寻一种方便、精准、无创的检查用于胃癌的筛查和诊断。外泌体是一种由多种细胞分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡，含有蛋白质、核酸等生物活性物质，通过传递其内容物给受体细胞，参与多种生理病理过程。近年来，诸多研究发现外泌体在包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展中发挥着重要作用。本文就外泌体与胃癌相关性的研究进展作一综述。

一、外泌体的生物学特性

1.外泌体的概述：Johnstone等[2]最早发现绵羊网织红细胞成熟过程中会以囊泡形式丢失大量细胞膜蛋白，后将该种囊泡命名为“外泌体”，起初外泌体仅被认为是细胞排泄废物的一种方式。目前外泌体特指由脂质双分子层构成的直径在40～100 nm，密度为1.13～1.19 g/mL的小囊泡[3]。内体膜内吞形成细胞内多囊泡体(multi-vesicular bodies,MVBs)，后者与质膜融合后，向胞外释放多个腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)，这些被释放入细胞外环境的ILVs即为外泌体[4-5]。除网织红细胞以及T细胞、B细胞、树突细胞、肿瘤细胞等非血源性细胞外，其余细胞均能分泌外泌体，外泌体几乎存在于人体所有体液中。

2.外泌体的构成：外泌体具有脂质双层膜结构，富含胆固醇和鞘磷脂，其内容物有蛋白质、脂质和核酸。外泌体的蛋白质成分复杂，分为非特异性蛋白和特异性蛋白两类。前者包括细胞骨架蛋白、四跨膜蛋白(CD63、CD81、CD9等)、多泡体生成相关蛋白(Alix、TSG101等)、细胞膜融合和转运相关蛋白(Rabs蛋白、联膜蛋白)、热休克蛋白(heat shock protein,HSP)、整合素等黏附分子、信号转导蛋白，其中CD63、CD81、Alix、TSG101等可作为外泌体的标记蛋白。后者与细胞来源相关，如结肠上皮细胞来源的外泌体含有多种代谢酶和肠组织特异性抗原；树突细胞来源的外泌体含有主要组织相容性复合物Ⅱ、CD86，与T淋巴细胞活化密切相关；肿瘤来源的外泌体通常含有肿瘤抗原和死亡诱导因子配体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、转化生长因子-β(TGF-β)等免疫抑制蛋白[6]。2007年Valadi等[7]首次在外泌体中发现了信使 RNA(mRNAs)、微RNA(miRNAs)等核酸类物质，具有生物活性，提示外泌体可能作为遗传信息的载体参与细胞间遗传物质的转移和表达。

3.外泌体的生物学功能：外泌体可通过质膜受体直接作用于受体细胞或通过转运其携带的核酸、蛋白质等生物活性分子进入受体细胞，参与多种生理过程。外泌体富集于肿瘤微环境中，肿瘤源性外泌体已被证明与肿瘤增殖、分化、迁移、耐药、血管新生以及免疫调节相关[8]。外泌体携带的生物活性分子具有其源性细胞的特征，这提示循环外泌体具有作为诊断癌症和评估预后的潜在价值。外泌体具有免疫源性低、在循环中稳定性好、易通过生物屏障等独特优势，可成为一种新型给药途径和基因治疗载体。

4.外泌体的分离、纯化方法：外泌体具有独特的理化性质：直径小(40～100 nm)，区别于核外颗粒体、脱落小泡和凋亡小体(1 000～5 000 nm)；脂质双分子层结构，沉降系数区别于蛋白质聚集体；具有标记蛋白CD63、CD81、Alix、TSG101等。上述特性有助于外泌体的分离和纯化，为研究外泌体与疾病相关性、外泌体用于诊断和治疗奠定了基础。目前采用的分离方法主要包括差速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、液相色谱法、超滤离心、基于复合物的沉淀法，但尚缺乏一种可同时保证外泌体含量、纯度和生物活性的分离方法。Retegui等[9]采用微流控平台在3 h内实现肿瘤特异性细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)与 RNA分离，且允许捕获的肿瘤 EVs 再释放，从而进行下游的进一步研究。

二、外泌体与胃癌的关系

1.外泌体与胃癌进展的关系

①外泌体与肿瘤微环境：相比正常细胞，肿瘤细胞通过释放更多的外泌体调节肿瘤微环境[10]。肿瘤微环境是一个由肿瘤细胞、间质细胞、细胞外基质等构成的动态网络，肿瘤细胞通过募集其附近的间质细胞并使其发生重塑，进而促进肿瘤的发生、发展和转移。成纤维细胞是肿瘤微环境中主要的间质细胞，其“活化”为肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)后，可通过多种途径促使肿瘤细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，参与肿瘤血管生成和侵袭、转移。外泌体在CAFs 的“活化”、EMT 过程中起重要作用。Gu 等[11]的研究发现胃癌细胞分泌的外泌体能将TGF-β转移至靶细胞，通过激活TGF-β/Smad信号转导通路促使人脐带间充质干细胞向CAFs转化。Guan等[12]的研究发现大剂量质子泵抑制剂(PPIs)可抑制胃癌细胞株SGC-7901外泌体的释放，进而减弱外泌体促CAFs转化和细胞因子释放作用。该研究还发现大剂量的PPIs不仅可调节缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路，从而抑制胃癌进展，亦能增强抗肿瘤药物的作用。该实验结果不仅是PPIs在胃癌治疗中的重要发现，亦是明确外泌体参与调控肿瘤微环境，有望成为胃癌治疗靶点的重要启示。此外，Zhang等[13]的研究发现，胃癌细胞以分泌外泌体的形式将表皮生长因子受体(EGFR)递送至肝脏并整合至肝基质细胞的质膜上，进而有效激活肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor， HGF)，上调的HGF与癌细胞c-MET受体结合，促进转移性肝癌生长。

②外泌体与胃癌细胞的增殖和侵袭：胃癌源性外泌体携带的蛋白质和miRNAs在肿瘤的增殖和侵袭中起关键作用。Li等[14]分别采用高表达CD97的胃癌细胞(SGC/wt)和低表达CD97的胃癌细胞(SGC/kd)分泌的外泌体处理胃癌细胞，经蛋白质印迹法检测发现SGC/wt分泌的外泌体通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路，包括上调细胞外信号调节激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK)和MAPK p38来促进肿瘤细胞增殖和侵袭。SGC/wt细胞来源外泌体携带的miRNAs可能与CD97相关信号通路激活有关，在CD97对肿瘤细胞行为的调控中扮演重要角色。Mao等[15]的研究发现，p53缺陷小鼠骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可通过调控Wnt信号通路将泛素蛋白连接酶E3α2(ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 2,UBR2)转移至小鼠前胃癌细胞，促进胃癌的生长和转移。该研究提供了胃癌进展的新机制，为胃癌治疗提供了新思路。Deng等[16]的研究发现，胃癌细胞株MGC803来源的外泌体可破坏腹膜间皮细胞层的完整性，使间皮下组织暴露于腹腔，利于种植转移瘤的生成，其机制与MAPK/ERK信号通路激活后外泌体诱导腹膜间质细胞凋亡和间皮间质转化相关。Let-7 miRNAs是Ras和高迁移率族蛋白A2的抑癌基因。Ohshima等[17]的研究发现，胃癌患者的let-7a miRNAs血浆浓度低于正常人，且肿瘤细胞分化越低，其表达下降越明显，推测胃癌细胞具有高转移性可能与细胞主动将let-7a miRNAs以外泌体形式排出有关。

2.外泌体在胃癌诊断中的应用：外泌体的体积和其携带的蛋白质、核酸可反映起源细胞的状态和类型。因此，循环中的肿瘤外泌体有助于肿瘤的早期诊断、液体活检。液体活检是通过检测血液、尿液等体液中的某些生物活性分子进而对疾病作出诊断的方法，具有非侵入性、快速、经济和可重复性的优点[18]。目前液体活检的检测对象主要包括循环肿瘤细胞、血浆游离DNA和外泌体[19]。Möhrmann等[20]的研究发现，对于BRAF、KRAS和EGFR 基因突变的检测，血浆外泌体核酸的敏感性更高。Loei等[21]采用相对和绝对定量放射性核素标记技术联合二维液相色谱-串联质谱分析胃癌细胞来源的外泌体蛋白谱后，发现血清颗粒体蛋白(granulin,GRN)在胃肿瘤组织尤其是早期胃癌中的表达水平显著高于正常胃组织。受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析亦证实血清GRN可作为诊断胃癌的生物学标记物。Tokuhisa等[22]采用基因测序和实时荧光定量 PCR技术检测外泌体miRNA谱，发现miRNA-21在恶性癌腹水中的信号强度最高；5个miRNAs (miR-1225-5p、miR-320c、miR-1202、miR-1207-5p和miR-4270)在恶性癌腹水、胃癌患者腹腔灌洗液和胃癌细胞培养液中表达均增高，可能与胃癌细胞腹腔扩散相关，其中miR-1225-5p在恶性癌腹水和腹腔灌洗液中的差异表达最显著。该研究表明外泌体miR-1225-5p和miRNA-21可提示胃癌的浆膜侵袭性，是胃癌术后腹腔复发转移的潜在生物学标记物。此外，有研究证实不同肿瘤细胞来源的外泌体具有不同的整合素表达谱，与肿瘤细胞转移的器官倾向性相关：整合素α6β4和α6β1与肺转移有关，整合素αvβ5与肝转移有关[23]。外泌体整合素可作为肿瘤转移器官倾向性的重要诊断指标。

3.外泌体在胃癌治疗中的作用：Han等[24]指出，外泌体对生物制药业具有一定意义。将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分泌的外泌体补充至细胞培养基可安全、有效地增加CHO细胞的活性，显著提高蛋白质的产量和质量。CHO细胞是生物制药的原料细胞，广泛应用于治疗性蛋白的生产。日本京都大学研究人员利用编码融合链霉亲和素(streptavidin,SAV)和乳凝集素(lactadherin,LA)的质粒载体转染鼠黑色素瘤B16BL6细胞制备出的表达 SAV-LA 的外泌体与生物素化的CpG DNA组合，制备出CpG DNA 修饰的外泌体CpG-SAV-exo，发现CpG-SAV-exo可有效激活鼠树突细胞并增强肿瘤抗原呈递能力[25]。在胃癌治疗方面，Gobbo等[26]的研究发现，肿瘤源性外泌体表面的 HSP70分子在肿瘤细胞的免疫逃逸中起重要作用，抑制其活性可提高肿瘤免疫疗法的疗效。同期有研究者发现可通过热激胃癌细胞获得高表达 HSP70的外泌体来致敏树突细胞，进而促进抗肿瘤免疫应答[27]。研究指出，肿瘤细胞可通过外泌体排出化疗药物从而导致耐药，提示外泌体可能成为攻克肿瘤耐药的重要靶点[28]。不断有研究提出外泌体作为药物载体或基因治疗载体的设想，找到最优的供体细胞是构建一个有效的外泌体药物递送的前提，未成熟树突细胞是外泌体的理想供体细胞[29]。目前，可通过外泌体递送的药物类型有小干扰RNA(siRNAs)[30-31]、miRNAs[32]、小分子化合物如姜黄素[33]、抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素[34]等。Zhang等[31]的研究显示，转染了HGF siRNA的外泌体可减缓癌细胞及其血管的生长速度。Wang 等[35]用转染了miRNA-21抑制剂的巨噬细胞来源外泌体处理胃癌细胞株BGC-823，使其 miRNA-21表达水平下降，结果显示癌细胞凋亡增加、转移能力显著下降，且外泌体限制了抑制剂对正常细胞的毒性。上述研究说明外泌体不仅可作为药物治疗的载体，其本身亦具有影响肿瘤代谢和免疫调节的优势，可利用这些优势解决胃癌治疗中常规化学制剂对正常细胞产生毒性作用的问题。

三、结语

综上所述，肿瘤来源外泌体通过多种机制参与胃癌的进展、侵袭、耐药、免疫调节等过程。外泌体在胃癌的早期诊断、药物治疗或基因治疗靶向载体等方面均有良好的临床应用前景，是目前研究的热点。但仍存在如下难题：①如何高效分离外泌体与其他类型的细胞外囊泡，同时保证外泌体数量、纯度和生物活性，为下游研究提供条件；②如何优化和标准化外泌体的纯化方法，并对获得的外泌体进行有效定量和定性；③外泌体载药的方式有电穿孔法、转染外泌体法、转染母代细胞等方法，各有优势和缺陷，有待进一步优化；④如何提高载药外泌体靶向性以解决肿瘤靶向治疗问题等。总之，随着人们对细胞外分泌、跨膜分泌等机制的深入研究，各种高敏感性、高特异性和高通量的分析手段的应用定会解决上述难题，为外泌体在胃癌诊疗中的应用开创新纪元。