氯离子通道-2与炎症性肠病关系的研究进展*

耿 丽 王许平 王丹丹 杨贝贝 杜晓博 高 闯 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科 郑州大学第二附属医院炎症性肠病中心 吴阶平医学基金会中国炎症性肠病联盟 河南省炎症性肠病中心(450014)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组病因不明、反复发作的肠道慢性炎症性疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，其发病率在全球和我国均呈上升趋势。目前认为IBD的发生主要与遗传易感性、肠道内环境以及宿主不恰当免疫应答有关[1-2]。氯离子通道(chloride channel,ClC)广泛分布于多种生物的细胞膜和细胞器膜上，是一类参与氯离子和其他阴离子转运的通道蛋白。电压门控ClC-2是ClC家族中的一员，近年来越来越多的证据表明ClC-2参与IBD的发生、发展。在肠道中，ClC-2存在于肠上皮细胞，可调控包括pH值、电兴奋性、离子运输等在内的多种生理过程和细胞功能，同时在IBD患者中，ClC-2可调节紧密连接复合体的结构，进而调节肠黏膜屏障功能，促进损伤的肠道上皮进行修复。本文就ClC-2与IBD关系的研究进展作一综述。

一、ClC-2的生物学基础

1.ClC-2的结构和功能：氯离子是生物体内含量最丰富的阴离子，其进出细胞除了依靠继发性主动运输(如Na+-K+-2Cl-同向转运体等)，还可依靠ClC。Miller[3]首先发现和克隆了电鳐(Torpedo)电器官中的ClC-0，此是首个被发现的ClC，随后依次发现了包括ClC-2在内的共9个亚型。ClC-2是由CLCN2基因编码、907个氨基酸构成的相对分子质量为99 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白质。目前已知ClC家族共用一个相对保守的蛋白质结构，该结构主要由18个部分跨膜、长度不等且反向平行的α螺旋和两个胞内的胱硫醚-β-合成酶结合域组成。蛋白质功能和结构分析表明，ClC通道蛋白的同型二聚体即“双筒枪(double-barreled)”通道结构是其最小的功能单位[4-5]。ClC-2参与多种生理过程和细胞功能，且具有器官和组织特异性，如在神经系统中抑制γ-氨基丁酸(GABA)反应[6]，在视网膜中调节离子稳态等[7]。此外还有调节细胞容积、参与盐的运输、调节细胞兴奋性等功能。其在消化系统中的作用并未完全阐明，有动物实验发现ClC-2可以调节胃液分泌以及在远端结肠中介导氯离子吸收[8-9]。但亦有动物实验表明，与野生小鼠相比ClC-2-/-小鼠胃液和肠液分泌并无明显差异，但确定的是ClC-2可调节肠黏膜紧密连接[10-11]。

2.ClC-2的分布和调节：ClC-2广泛分布于多种哺乳动物心、脑、肾、消化道等上皮细胞的细胞膜上。在小肠，其主要分布于小肠绒毛上皮细胞顶端。此外基底外侧膜、肠上皮细胞胞质区亦有所分布，而在隐窝中并无分布[12]。研究[13]表明，在小鼠和猪的小肠中，ClC-2主要分布于紧密连接复合体所在的区域，此种分布方式一方面有利于ClC-2与紧密连接复合体中的分子进行交流，另一方面可能与小肠中ClC-2介导氯离子进出上皮细胞有关。

ClC-2在正电位的情况下处于关闭状态，但可在超极化状态下被缓慢激活。细胞水肿、细胞外低渗或酸性环境均可激活ClC-2，此外甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸(T3)和四碘甲状腺原氨酸(T4)、神经胶质细胞黏附分子(glial cell adhesion molecule,GlialCAM)、脂肪酸等亦对ClC-2具有调节作用[4,14-15]。药物如鲁比前列酮(lubiprostone)等可激活肠道上皮细胞中的ClC-2，诱导小肠液分泌，促进受损的肠道黏膜修复[16-17]。

二、ClC-2与IBD的关系

1.ClC-2数量变化与实验性结肠炎和IBD的关系：2004年Moeser等[17]的研究发现，在缺血损伤的猪回肠黏膜中ClC-2表达增加，推测其可能与肠道损伤修复有关。2009年该团队又发现在缺血损伤的小鼠空肠中ClC-2表达增加，而在ClC-2-/-小鼠损伤肠道修复受阻[13]。近年来，诸多研究表明ClC-2数量或分布的变化与实验性结肠炎和IBD密切相关[18]。Nighot等[19]采用免疫组化法测定小鼠结肠中ClC-2分布。与健康对照组相比，葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎的小鼠ClC-2总表达无明显变化，但其在小鼠肠道表层上皮的核上胞质区呈现出明显聚集状态，而在上皮细胞顶侧膜的分布却显著减少。同时发现在ClC-2-/-小鼠中，肠道通透性和结肠炎的严重程度均较健康对照组明显增加。此外发现在UC患者体内，ClC-2表达显著降低。Jin等[20]亦发现预防性应用ClC-2激活剂鲁比前列酮可降低DSS诱导小鼠结肠炎的严重程度，已诱导产生结肠炎的小鼠应用鲁比前列酮后可使肠道受损黏膜恢复加快。

2.ClC-2与肠黏膜屏障：肠黏膜屏障中含有各种高度有序的细胞间连接，主要包括黏着连接(adherens junction)、桥粒(desmosome)、缝隙连接(gap junction)、紧密连接(tight junction)等[21]，其中紧密连接是调节肠上皮屏障功能的重要组分。细胞间紧密连接主要由多种紧密连接蛋白组成，包括闭锁小带蛋白(ZO-1)、封闭蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudins)、钙黏蛋白(cadherin)等，正常情况下紧密连接是肠道细胞抵御有害物质侵袭的第一道防线[22]。研究指出，紧密连接破坏导致的肠道通透性增加是肠道炎症发生、发展的重要因素[23-24]。ClC-2主要位于小肠绒毛顶端的紧密连接区域，在稳态和病理状态下其对肠黏膜屏障的作用有所不同，在IBD动物模型中，其可通过调节紧密连接的结构和组分进而促进肠道屏障功能的恢复。

①ClC-2与正常肠黏膜：ClC-2对正常肠黏膜的作用目前尚存争议。有研究[25]表明在小鼠正常肠道上皮中ClC-2会导致屏障功能减弱，主要表现为ClC-2-/-小鼠肠道跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TER)较正常对照组明显增加，被标记甘露醇的清除率明显降低，提示肠黏膜通透性降低。同时发现ClC-2-/-小鼠肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)介导的肌球蛋白轻链(myosin light chain， MLC)磷酸化明显减少。有文献报道MLCK的诱导激活可破坏细胞间紧密连接，增加肠黏膜通透性，进而减弱屏障功能，该发现与上述研究结果一致[26]。ClC-2-/-小鼠与正常小鼠相比，肠绒毛超微结构发生明显变化，表现为绒毛顶端变细，横向纹路增多，且紧密连接界限不清。ClC-2导致正常肠道上皮屏障功能减弱的具体机制目前尚未明确，推测其可能作为一种离子通道，在肠黏膜上造孔供离子进出，从而破坏了黏膜的完整性[27]。然而，另有研究[28]表明，在早期的单层Caco-2细胞中，用小干扰RNA沉默ClC-2基因会导致TER形成延迟以及影响occludin蛋白定位。同时在ClC-2过表达的Caco-2细胞中，菊粉和10 kDa葡聚糖流量明显降低，同时TER较对照组明显增加，表明在Caco-2细胞中ClC-2对上皮屏障功能发挥有益效应[29]。

②ClC-2与受损肠黏膜：肠黏膜屏障是肠道重要的结构和功能屏障，对于水分、离子以及营养物质的吸收至关重要，同时亦可抵御毒素和病原体入侵[30]。机械屏障是肠黏膜屏障的重要组成部分，其结构基础为完整的肠上皮细胞和细胞间的紧密连接。紧密连接结构的破坏会导致肠壁通透性增加，进而引起炎症反应[31]。肠黏膜完整性的破坏和紧密连接的改变在IBD的发生、发展过程中至关重要。

Moeser等[17]研究猪回肠缺血性损伤时发现前列腺素E2可诱导短路电流产生以及TER显著增加，提示肠黏膜通透性降低，屏障功能恢复。进一步研究表明该短路电流的产生主要与氯离子分泌有关，ClC-2与occludin蛋白在上皮细胞中的共表达对肠黏膜屏障功能的修复起着至关重要的作用。另有研究表明，在DSS诱导的ClC-2基因沉默的Caco-2细胞中，TER的下降程度显著高于阴性对照组细胞[27]。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，紧密连接蛋白的数量和分布均与野生型明显不同，在ClC-2-/-小鼠中此种差异更为显著。Claudin-2作为一种成孔蛋白，能诱导肠黏膜对小分子物质通透性增加，其在IBD动物模型和UC患者中表达增高[19]，预防或治疗性应用ClC-2激活剂后，DSS诱导的野生型小鼠claudin-2表达显著降低[20]。此外，ClC-2可介导occludin蛋白在胞膜和胞质内转运。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，occludin蛋白在胞膜的含量减少，在胞质中含量增多，ClC-2-/-小鼠由小窝蛋白-1(caveolin-1)和质膜微囊参与的occludin蛋白从胞质至胞膜的转运受限，因此紧密连接恢复受阻[19,20,27]，目前为止，ClC-2调节occludin蛋白运输的具体机制尚未完全阐明，可能与其自身构象改变以及胞膜上某些受体有关，但可明确的是其对多种紧密连接蛋白的调节有利于紧密连接复合体重新装配，促进了DSS诱导结肠炎小鼠肠道屏障功能的恢复。

上述研究结果表明，ClC-2在肠黏膜中可能发挥着双重作用，一方面在正常肠道中，ClC-2缺失会引起肠黏膜通透性降低以及肠黏膜屏障功能提高，另一方面在IBD等疾病导致的受损肠黏膜中，ClC-2缺失会导致疾病严重度增加，肠道通透性增加，紧密连接复合体装配受阻，应用ClC-2激活剂则可促进肠黏膜屏障功能修复，提示ClC-2在受损肠黏膜中发挥保护作用，该作用可能是通过调节紧密连接蛋白在胞膜和胞质中的循环实现的。

三、ClC-2与细胞因子

在DSS诱导的结肠炎中，ClC-2-/-小鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及其mRNA水平较野生型小鼠成倍增加，干扰素(IFN)-γ亦有所增加，此类促炎因子可诱导MLCK激活，破坏细胞间紧密连接，降低屏障功能，诱导或加重炎症反应[17,19]。同时有体外实验证实了细胞间紧密连接通透性的增加与上述occludin蛋白的转运无关[32]。Monteleone等[33]指出，在CD中TNF-α、IFN-γ等可激活辅助性T细胞17(Th17)等相关细胞，引起肠道炎症反应，进而导致IBD发生。这些细胞因子的改变与ClC-2-/-小鼠结肠炎的严重程度一致。此外，Jin等[20]亦发现，预防或治疗性应用ClC-2激活剂后，在DSS诱导的野生型小鼠结肠炎中，结肠TNF-α和IL-1β含量明显降低，IL-10含量增加。在远端结肠中，转化生长因子(TGF)-β表达明显增加，可能与ClC-2激活剂抑制肠道炎症反应，干扰抗炎细胞因子的信号转导有关。

四、结语

ClC-2是IBD发病机制中起重要作用的一种离子通道，可影响多种细胞因子的表达，缓解肠道炎症，同时在肠黏膜修复过程中，可通过改变紧密连接蛋白的含量和分布，调节紧密连接复合体的装配，从而促进受损肠黏膜的修复。对ClC-2的深入研究有助于更好地阐明IBD的发病机制，同时可应用针对ClC-2的靶向激活药物，为IBD的治疗提供新思路。