镉胁迫对猪肾PK-15细胞活性氧和抗氧化酶活性的影响

杨佳，董峰，李向阳，王兰

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

土壤和水体中的镉被植物吸收后，导致粮食和饲料被污染[1-4]。饲料添加剂中镉含量超标，通过摄食和饮水进入动物体，造成动物性食品的污染[5]，不但降低了畜产品的经济营养价值，而且极大地威胁着我国畜牧业的发展与人类健康[6-7]。

镉蓄积于生物有机体后，引起肾脏、肝脏、睾丸等多种组织器官的损伤，其中肾脏是镉的主要靶器官[8]。韩新燕等[9]研究发现，镉污染的饲料严重影响猪的生长性能。镉可以引起小鼠肾脏水肿，肾小球萎缩、退化，近端肾小管出现空泡化、坏死及炎症细胞侵润的现象[10]。镉与铅联合染毒引起绵羊肾小管上皮严重变性、坏死，伴随有亚急性肾小球肾炎[11]。镉还能引起SD大鼠近端肾小管细胞形态发生显著性变化，出现细胞皱缩变圆、黏附性降低[12]。但是，镉引起猪肾脏细胞病变的细胞分子机制目前还不是十分清楚。

鉴于此，我们以猪肾PK-15细胞为研究材料，检测镉胁迫引起的PK-15细胞形态变化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成及抗氧化酶活的变化，阐明镉作用的细胞分子机制，旨在为探讨镉致动物肾脏毒性损伤的机理，以及重金属对畜牧业养殖的毒性作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肾细胞PK-15购于美国组织培养库（Amer⁃ican Tissue Culture Colection，ATCC）。

氯化镉（CdCl2·2.5H2O）（天津市风船化学试剂科技有限公司）；DMEM高糖培养基（HyClone公司）；0.25%胰蛋白酶（Biosharp公司）；特级胎牛血清（FBS）（生工生物工程有限公司）；噻唑蓝（MTT）（Solarbio公司）；二甲基亚砜（DMSO）（登峰化学试剂厂）；Triton X-100（西亚试剂公司）；N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（Sigma公司）；活性氧检测试剂盒及Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；总超氧化物歧化酶（TSOD）测试盒、过氧化氢酶（CAT）测试盒、微量还原型谷胱甘肽（GSH）测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 细胞培养

PK-15细胞在含5%FBS的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。呈典型上皮细胞的形态，待细胞长满底壁约90%时，用0.25%胰酶消化收集细胞，并按适当比例接种至新的细胞培养瓶中传代培养。

1.3 MTT法检测细胞存活率

收集对数生长期细胞，按5×103/孔接种于96孔板，置37℃、5%CO2培养箱中培养。设置调零组、对照组和CdCl2处理组，每组4个重复。待细胞长满底壁约60%时弃去培养液，PBS清洗细胞。对照组加入新鲜培养液，CdCl2处理组加入不同浓度 CdCl2溶液（2、4、6、8 μmol/L），置培养箱中培养24 h。处理结束后，每孔加10 μL 5 mg/mL的MTT溶液，避光孵育4 h后弃去培养液，每孔加150 μL DMSO溶液，振荡10 min。用酶标仪检测各孔的D490nm值，计算细胞存活率［细胞存活率=（测定孔D490nm值－调零孔D490nm值）/（对照孔D490nm值－调零孔D490nm值）×100%］。

1.4 显镜观察细胞形态及细胞内ROS的变化

收集对数生长期细胞，按3.5×104/孔接种于24孔板，每孔500 μL培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养。设置对照组、CdCl2处理组、CdCl2+NAC处理组，每组3个重复。细胞长满底壁约60%时弃去培养液，PBS清洗细胞。对照组加入新鲜培养液；CdCl2处理组加入不同浓度CdCl2处理细胞 24 h；CdCl2+NAC 处理组用 500 μmol/L NAC提前孵育细胞2 h，之后加入不同浓度CdCl2与NAC共处理细胞24 h。处理结束弃去培养液，PBS清洗细胞，每孔加入250 μL DCFH-DA溶液（用无血清培养液按1∶1000稀释，终浓度10 μmol/L）于培养箱中避光孵育30 min。孵育结束后，PBS清洗细胞，每孔加500 μL PBS，于光镜和荧光显微镜下观察。

1.5 用试剂盒测定细胞内抗氧化酶的变化

收集对数生长期细胞，按2×106/皿接种于100 mm细胞培养皿，于37℃、5%CO2培养箱中培养。设置对照组，CdCl2处理组。细胞长满底壁约50%时弃去培养液，PBS清洗细胞后加不同浓度的CdCl2处理细胞，对照组更换等体积新鲜培养液，于培养箱中培养24 h。处理结束后收集细胞，加入含0.1%Triton X-100的Tris-HCl重悬细胞，置冰上20 min，之后用电动匀浆仪破碎细胞，冰浴，12 000 r/min匀浆4 min。收集细胞匀浆液，用Bradford蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，用相应试剂盒检测T-SOD、CAT活性和GSH含量。结果均以相对活性/含量来表示T-SOD、CAT活性及GSH含量的变化。

1.6 数据分析

数据采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，各项实验至少进行3次独立重复实验，结果均以平均值±标准误（mean±SEM）表示。*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 CdCl2对PK-15细胞活性的影响

如图1所示，CdCl2处理PK-15细胞24 h后，随着CdCl2浓度的增加，细胞活性逐渐下降（P＜0.05，P＜0.01），呈剂量-效应关系 。 2、4、6、8 μmol/L CdCl2浓度下的细胞存活率依次为87.65%、66.49%、48.85%和36.34%。

2.2 CdCl2对PK-15细胞形态和ROS的影响

用不同浓度的CdCl2处理PK-15细胞24 h，对照组细胞呈典型的上皮样细胞形态。随着CdCl2浓度的增加，细胞逐渐皱缩，间隙变大，变圆，甚至脱落（图2A）；用DCFH-DA探针标记细胞内的ROS，荧光显微镜观察，发现荧光强度随着CdCl2浓度的增加而加强（图2B）；用抗氧化剂NAC和CdCl2共同处理PK-15细胞24 h，光镜观察发现，NAC和CdCl2处理组（图2C）与CdCl2处理组（图2A）相比，细胞皱缩程度减弱，变圆，脱落，细胞减少；用DCFH-DA探针标记NAC和CdCl2处理组细胞，细胞内ROS荧光强度较弱，且随着CdCl2浓度的升高变化不明显（图2D）。

图1 CdCl2对PK-15细胞活性的影响（n=4）

2.3 CdCl2对PK-15细胞内抗氧化系统的影响

CdCl2处理PK-15细胞24 h，检测PK-15细胞内抗氧化物酶SOD和CAT的活性及GSH的含量变化。结果表明（图3A），与对照组相比，SOD活性随着CdCl2浓度增加呈上升趋势，且浓度为8 μmol/L时T-SOD活性最高且差异显著（P＜0.05）；如图3B所示，不同浓度CdCl2处理下，PK-15细胞内的CAT活性均低于对照组，且差异极显著（P＜0.01）；观察图 3C 发现，2 μmol/L CdCl2处理的细胞，GSH 的表达增加，当 CdCl2浓度达 6、8 μmol/L时，细胞内GSH含量显著增加（P＜0.05）。

3 讨论

镉能通过抑制线粒体呼吸链电子传递或诱导组织或细胞发生氧化应激，产生大量的ROS，ROS主要包括超氧阴离子自由基（·）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH·）[13]。本研究结果表明，PK-15细胞在不同浓度CdCl2作用下，细胞活性显著降低；用特异性荧光探针DCFH-DA标记发现，细胞内ROS荧光强度随着CdCl2浓度增加而加强，细胞逐渐皱缩、变圆、脱落。NAC是一种含有巯基的活性氧清除剂，与CdCl2共处理细胞发现，细胞内ROS荧光强度比Cd单独处理组显著下降，细胞皱缩、变圆程度明显降低，说明CdCl2胁迫下PK-15细胞的形态病变与ROS生成有关。周筱轩等[14]用CdCl2与NAC共处理人乳腺癌MCF-7细胞6 h后使ROS荧光强度明显降低；汪纪仓等[15]也用NAC与醋酸镉（CdAc2）共处理肝细胞24 h后发现明显减少了镉所致细胞皱缩及坏死现象。以上研究报道与本实验结果相似，表明镉胁迫PK-15细胞发生氧化应激介导的细胞损伤。

图2 CdCl2处理（A、B）、NAC和CdCl2共处理（C、D）对PK-15细胞形态（A、C）和ROS（B、D）的影响

图3 CdCl2对PK-15细胞内T-SOD（A）、CAT（B）、GSH（C）的影响（n=3）

细胞内存在天然的抗氧化系统，是细胞抵抗外源物胁迫的第一道防线。GSH是一种含巯基的蛋白，作为细胞内重要的抗氧化剂，能有效清除自由基。抗氧化酶主要是T-SOD和CAT，TSOD能特异性歧化·为 H2O2和 O2，产物 H2O2也具有强氧化性，能被CAT催化为H2O。抗氧化系统成分之间存在紧密的相互作用[16-17]，过量的ROS使得细胞内抗氧化系统失衡，抗氧化系统的消耗又会增加细胞内的ROS。本实验结果表明，随着CdCl2浓度增加，细胞内ROS含量逐渐增加，并且T-SOD活性随CdCl2浓度升高呈上升趋势，CdCl2达 8 μmol/L 时，T-SOD 活性著性增加。TSOD活性升高，一方面可能是CdCl2诱导T-SOD基因表达，另一面·增多也会导致T-SOD表达增加[18]。汪纪仓等[15]用 2.5、5、10 μmol/L 的 CdAc2处理大鼠肝细胞24 h后，SOD活性显著增加。也有研究表明，CdCl2处理组织或细胞引起SOD活性降低[19]，这可能与药物种类、处理时间、药物浓度和细胞种类等因素相关。本研究结果显示，不同浓度CdCl2处理下的PK-15细胞内CAT活性显著低于对照组，推测是镉胁迫下，PK-15细胞内ROS的增多诱导T-SOD活性增加，T-SOD分解·形成的产物H2O2也增多，清除增多的H2O2需要消耗大量CAT，使得CAT活性极显著下降[20]；也可能是合成CAT的速度低于清除H2O2消耗的速度，导致CAT酶活极显著下降[21]。还有可能，CAT是以铁卟啉为辅基的结合酶，其中Fe3+是分解H2O2的主要位点，而游离的Cd2+可能与Fe3+发生替换，导致CAT构象改变并失活，而游离态的Fe3+也会触发Fenton反应，产生更多的自由基，导致CAT活性降低[22]。Jurczuk等[23]研究表明，给鼠喂食50 mg/L的含CdCl2水能引起鼠肾脏组织SOD活性升高，CAT活性下降。本实验中CAT活性在8 μmol/L CdCl2作用下稍有升高，同浓度下T-SOD活性及GSH含量显著增加，可能是细胞应对镉产生了耐受性。图3C表明，低浓度下细胞内GSH含量增加，这可能是细胞的一种应激反应，GSH可以分解H2O2为H2O，GSH含量显著增加可能是随着ROS的增加和SOD活性增加产生的H2O2逐渐增多诱导了GSH的表达。同时，CAT活性下降，增加GSH的含量用于抵抗镉毒性。Gaubin等[24]研究表明，低浓度CdCl2（0、1、5、10 μmol/L）作用人肺腺癌细胞A549引起细胞内GSH显著增加，但高浓度CdCl2（25、50、75、100 μmol/L）作用下 GSH 显著性降低，低浓度下的GSH增加是细胞抵抗镉毒性的一种自我保护结果，与本实验中结果相似。Nzengue等[25]用 15、50、100 μmol/L CdCl2处理 HaCaT 细胞24、48 h，发现GSH含量极显著增加。

此外，镉诱导组织或细胞产生大量ROS也可能直接造成DNA、蛋白质等生物大分子的氧化损伤，产生功能障碍。DNA损伤会造成基因组不稳定，继而引起细胞周期阻滞等生物学现象[26-28]。过量的ROS还会引起细胞内线粒体膜损伤，降低线粒体膜电位，改变其通透性，最终导致细胞凋亡的发生[29-30]。CdCl2胁迫对PK-15细胞DNA、细胞周期和细胞凋亡的影响有待进一步研究。

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