马尔堡病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达与纯化

张冠英，迟象阳，范鹏飞，房婷，吴诗坡，陈旖，王美荣，陈郑珊，于长明，陈薇

军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）是一种烈性病原体，感染人和非人灵长类动物可引起严重的急性出血热病，病死率超过80%。MARV可以通过血液、唾液、排泄物及呕吐物等体液传播。MARV与2014年在西非肆虐的埃博拉病毒同属丝状病毒科，为单股负链RNA病毒，基因组全长约19 kb，编码7个结构蛋白，其中糖蛋白（glyco⁃protein，GP）在病毒黏附、进入细胞过程中发挥重要作用[1]，是抗体和疫苗研究的关键靶标。

GP为Ⅰ型跨膜糖蛋白，在病毒膜表面以三聚体的形式存在，每个单体由通过二硫键连接的GP1和GP2亚基构成。GP1包括受体结合区域（receptor binding region，RBD）、2个高度糖基化的区域聚糖帽（glycan cap，GC）和粘蛋白区（mu⁃cinlike domain，MLD）；GP2包含内融环（internal fusion loop，IFN）和 跨 膜 区（transmembranedo⁃main，TM）[2-3]。目前已报道的很多MARV的抗体结合表位都位于GP1亚基[4-6]，因此表达构象正确、生物学活性良好的GP1，对于筛选和检测MARV抗体十分重要。在本研究中，我们构建了GP1的真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达获得可溶性GP1，为MARV抗体和疫苗的检测与评估提供了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Expi293细胞，pcDNA3.4、pDC316-MAGPopt质粒、炭疽单抗8A7由本实验室保存；大肠杆菌Top10感受态细胞购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ，T4DNA连接酶购自NEB公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；去内毒素质粒小提试剂盒购自Promega公司；Ex⁃pi293细胞培养基及转染试剂购自ThermoFisher公司；HisTrap预装柱购自 GE Healthcare公司；West⁃ern化学发光显色液购自Millipore公司；羊抗人IgG抗体（HRP）及Anti-His抗体（HRP）抗体购自Abcam公司；结合于GP1亚基的MARV特异单抗rMR191、rMR78由本实验室重组表达；TMB单组分显色液、ELISA终止液购自索莱宝公司。

1.2 重组表达质粒构建

pDC316-MAGPopt包含经人密码子优化后的Angola株MARV GP的全长基因序列，并用tPA信号肽替换了病毒原始的信号肽。以pDC316-MAGPopt为模板，设计上游引物（CCGGAATTCG CCGCCACCATGGACGCCATGAAGCGG）和下游引物（CCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTC GCTTCCGGCGGAAGTA）PCR扩增GP1片段，上游引物含EcoRⅠ酶切位点，下游引物含6×His标签和HindⅢ酶切位点（PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共30个循环；72℃再延伸10 min），回收PCR产物，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，用T4DNA连接酶将酶切后的目的基因片段与经同样双酶切的pcDNA3.4质粒连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取单克隆由生工生物工程股份有限公司测序，选取正确克隆提取质粒pcDNA3.4-GP1。

1.3 GP1在哺乳动物细胞中的表达

转染前一天，接种2×106细胞到30 mL Ex⁃pi293 Expression Medium 中 ，在 5% CO2、37℃ 、120 r/min条件下悬浮培养；转染当天，检测细胞密度达 3×106/mL 时，取 80 μL ExpiFectamine293转染试剂加入1.5 mL培养基中，混匀后室温孵育5 min；取 30 μg构建的表达载体 pcDNA3.4-GP1加入1.5 mL培养基中，混匀后与含有转染试剂的培养基混合，室温孵育25 min，然后加入细胞培养瓶中；培养12 h后，在细胞培养瓶中加入150 μL转染增强剂1和1.5 mL转染增强剂2；继续培养84 h后，将细胞培养物3000 r/min离心20 min，留上清。

1.4 Western印迹检测蛋白表达

取细胞表达上清，加入含DTT的6×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，离心后上样，电泳结束后转移蛋白到硝酸纤维素膜上，电转条件为300 mA、1 h；用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入rMR191（0.5 μg/mL）和 Anti-His抗体（1∶2000 稀释）室温孵育1 h，洗膜后再分别加入带HRP的二抗，再次洗膜后滴加化学发光试剂，在化学发光成像系统中曝光。

1.5 Histrap柱亲和层析纯化GP1

用0.22 μm滤膜抽滤Expi293细胞表达上清，Histrap亲和柱用平衡缓冲液（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）平衡后上样，上样结束后再平衡，用洗脱缓冲液（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）梯度洗脱蛋白，收集洗脱峰。

1.6 ELISA检测GP1的免疫反应性

包被 1 μg/mL 纯化的 GP1，4℃孵育过夜；PBST洗涤4次后，用2%BSA于37℃封闭1 h；洗涤后加入初始浓度100 μg/mL的rMR191、rMR78、8A7，以1/3梯度稀释，37℃孵育1 h；洗涤后加入HRP标记的羊抗人二抗，37℃孵育1 h；洗涤，加入TMB单组分显色液显色6 min，加入终止液，读取D450nm/D630nm值。

2 结果

2.1 GP1表达质粒的构建与鉴定

PCR扩增得到1370 bp的GP1片段（图1），经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接到pcDNA3.4载体，双酶切构建好的pcDNA3.4-GP1表达载体，得到6000和1370 bp条带（图2），说明目的基因克隆到pcDNA3.4载体。基因测序结果与原序列一致，没有碱基缺失与突变。

2.2 Western印迹检测蛋白表达

将真核表达质粒pcDNA3.4-GP1瞬时转染到Expi293细胞中进行表达，分别用抗MARV GP1的抗体rMR191（图3A）和抗His标签抗体（图3B）作为一抗对表达上清进行Western印迹检测。结果显示，在还原条件下，检测到相对分子质量为120 000～250 000的条带，条带呈弥散状的原因是GP1含有大量糖基化位点，糖基化修饰使得蛋白的相对分子质量不均一。

2.3 ELISA检测GP1的免疫反应性

用纯化的GP1包被酶联板，对抗MARV GP1的单抗rMR78、rMR191以及作为对照的炭疽单抗8A7进行检测，结果见图4，2株特异抗体可以与GP1结合，而对照抗体8A7不能结合GP1。提示哺乳动物细胞表达的GP1构象正确，具有良好的免疫反应性。

图1 PCR扩增GP1基因

图2 重组质粒pcDNA3.4-GP1的双酶切鉴定

3 讨论

MARV是一种烈性病原体，严重威胁人类的生命健康，但目前国际上尚无获批的疫苗与特异性治疗药物[7]。MARV糖蛋白是目前疫苗和抗体研究的主要靶点，获得纯化的蛋白对研究MARV有重要意义。

目前表达丝状病毒GP主要利用原核表达系统或昆虫细胞表达系统[8-11]。原核表达系统体系成熟，可以在较短时间内获得基因表达产物，但是也存在一些难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。昆虫细胞表达系统能够对目的蛋白做翻译后修饰，但这种修饰存在一定的限度；其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样，但寡糖链的性质有所不同，无法产生复杂的糖基侧链[12]。哺乳动物细胞表达真核蛋白可以较为准确地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等翻译后加工过程，产生的蛋白具有良好的生物学活性，且接近蛋白的天然构象，另外可溶性表达降低了检测和纯化目的蛋白的难度[13]。

图3 Western印迹鉴定 GP1（A：rMR191；B：Anti-His）

图4 ELISA鉴定Expi293细胞表达的GP1

MR78和MR191是Flyak等制备的2株MARV的中和抗体，它们结合的抗原表位都位于GP1亚基，但结合角度略有不同。本实验室重组表达了这2株抗体，并用它们对GP1进行检测，发现2株抗体都可以与GP1结合，提示重组表达的GP1构象正确，可用于中和抗体筛选与中和表位鉴定。

本实验在哺乳动物细胞中对MARV糖蛋白GP1亚基进行重组表达，构建了真核表达载体pcDNA3.4-GP1，瞬时转染Expi293细胞，在细胞培养上清中检测到可溶性表达的目的蛋白，纯化后的蛋白通过ELISA鉴定构象正确，具有免疫反应性。本研究获得了GP1亚基，对丝状病毒糖蛋白的表达有借鉴意义，为MARV疫苗的评价、特异性单抗的筛选及抗体的中和机制研究等提供了有效的生物材料。

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