截短型马尔堡病毒包膜糖蛋白的原核表达纯化及鉴定

闻雁波，吴诗坡，侯利华，陈薇

军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）属于丝状病毒科，是一种能够引起急性出血热的烈性病原体，具有极高的致死率[1]。MARV为单股负链RNA病毒，共编码7种结构蛋白，即NP、VP35、L、VP30、VP24、GP、VP40[2]，其中包膜糖蛋白（glyco⁃protein，GP）能够介导病毒进入细胞，已被证实是保护性抗原，因此通常将其作为疫苗研制的靶标抗原[3]。目前，世界上尚无批准上市的马尔堡病毒疫苗，而由于其高度的致死性以及被用作生物战剂的可能性[4]，研发针对此病毒的安全有效的疫苗刻不容缓。我们以MARV GP为研究对象，设计并构建4种截短型GP，利用大肠杆菌表达纯化，获得了纯度较高、抗原性良好的截短GP，可用于MARV疫苗的免疫原性及MARV GP抗体的结合活性评价。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌感受态细胞Top10、BL21购自天根生化有限公司；质粒pET-32a、pPDC316-MAGPopt为本实验室保存；引物由生工公司合成；Ex-Taq酶、凝胶回收、质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；HisTrap Ni柱、HiTrap Q柱购自GE公司；HRP羊抗鼠IgG二抗购自Abcam公司；化学发光显色液购自Millipore公司。

1.2 原核表达质粒构建

根据MARV GP亲疏水性质设计4种GP抗原（图1），以pDC316-MAGPopt为模板扩增基因片段MAGP40-289、MAGP148-526、MAGP240-526和 MAGP258-526，回收PCR产物，酶切后连接pET-32a载体，转化感受态大肠杆菌Top10，涂氨苄西林抗性平板过夜，挑单克隆进行平板划线，同时菌落PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆送生工公司测序，测序引物为T7-F、T7-R，序列正确的克隆提质粒进行后续实验。

1.3 重组蛋白诱导表达

鉴定正确的阳性克隆质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布氨苄西林抗性LB平板，过夜培养后，挑单克隆在新的氨苄西林抗性LB平板上划线培养，同时再次做菌落PCR鉴定（应为阳性）。从划线平板上挑取各对应转化菌到5 mL含氨苄西林（100 μg/mL）的 LB培养基中，37℃、220 r/min振荡培养，菌液D650nm值达0.6～0.8时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，28℃诱导表达6 h，3000 r/min离心10 min收集菌体沉淀，加入1 mL PBS重悬，超声波破碎5 min，12 000 r/min离心10 min，分别取上清、沉淀（用等体积PBS重悬），加入6×SDS-PAGE上样缓冲液，99℃加热5 min，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达。

图1 4种截短型GP结构示意图

1.4 重组蛋白大量表达及纯化

将甘油保存的阳性克隆菌液按1∶100转接到5 mL含氨苄西林（100 μg/mL）的LB培养基中，37℃、220 r/min振荡培养过夜，次日将5 mL菌液加到1 L含氨苄西林（100 μg/mL）的LB培养基中，37℃、220 r/min振荡培养，菌液D650nm值达0.6～0.8时加入1 mmol/L IPTG，28℃培养6 h，8000 r/min离心5 min收集菌体，用80 mL缓冲液（含20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl）重悬，转移到100 mL烧杯中，置于冰水混合物上进行超声波破碎（工作时间5 s，间隔时间5 s，超声时间15 min），超声后溶液12 000 r/min离心20 min，取上清进行纯化。纯化仪开机装上Ni柱后，用去离子水走2～3个柱体积，随后过100 mmol/L NiSO4溶液至柱子变为均一绿色，电导值平衡，再用去离子水过2～3个柱体积，用缓冲液（20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl）平衡柱子至电导值稳定。超声后上清溶液过Ni柱上样，用洗脱缓冲液（含20 mmol/L PB，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑）进行线性梯度洗脱，洗脱完毕用50 mmol/L EDTA洗脱Ni离子，用去离子水、20%乙醇清洗柱子，Sepharose Q柱纯化过程与Ni柱类似，将Ni柱纯化后的收集峰用缓冲液（20 mmol/L Tris，10 mmol/L NaCl，pH8.0）稀释至 1/10后上样，用缓冲液（20 mmol/L Tris，1 mol/L NaCl，pH8.0）进行线性梯度洗脱。收集峰加SDS上样缓冲液，加DTT，99℃加热5 min后SDS-PAGE分析纯化结果。

1.5 Western印迹

纯化后的MAGP240-526蛋白经SDS-PAGE，转到硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，用实验室制备的Ad5-MAGPopt疫苗候选株免疫后的小鼠血清（1∶500稀释于5%脱脂牛奶中）室温孵育1 h；TBST洗涤4次，每次7 min；加入HRP羊抗兔二抗，室温孵育 1 h；TBST洗涤4次，每次7 min；淋加化学发光显色液反应片刻后曝光。

1.6 ELISA实验

MAGP240-526蛋白以2 μg/mL的浓度包被酶标板，4℃包被过夜，次日用PBST洗涤3次，每次5 min；用5%牛血清白蛋白于37℃封闭1 h；PBST洗涤3次后，分别加入Ad5-MAGPopt免疫的小鼠血清、猴血清（起始稀释率为1/100，1/3倍比稀释），37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，分别加入HRP羊抗鼠、羊抗猴二抗（1∶20 000稀释），37℃孵育1 h；洗涤，加100 μL TMB单组分显色液，37℃显色6 min，加入终止液终止反应，测定D450nm值。

2 结果

2.1 重组表达载体的构建

PCR 扩增 DNA 片段 MAGP40-289，MAGP148-526，MAGP240-526，MAGP258-526后核酸电泳结果显示条带大小正确（图2）。将扩增产物酶切后插入原核表达载体pET-32a，该载体含有Trx蛋白基因和His标签，有利于目的蛋白的融合表达及后期用Ni柱纯化[5]。重组质粒 pET-32a-MAGP40-289、pET-32a-MAGP148-526、pET-32a-MAGP240-526和 pET-32a-MAGP258-526测序结果与原序列一致，碱基序列未发生突变。

2.2 目的基因的诱导表达及纯化

将重组质粒pET-32a-MAGP40-289、pET-32a-MAGP148-526、pET-32a-MAGP240-526、pET-32a-MAGP258-526分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，28℃诱导表达，菌体超声波破碎后行SDS-PAGE鉴定，只有pET-32a-MAGP240-526能够可溶表达于上清中（图3），其他构建载体虽表达目的蛋白，但大多以包涵体形式存在，纯化、复性步骤繁琐。对MAGP240-526进行大量表达纯化，经先Ni柱再阴离子柱的两步纯化法获得纯度为90%的截短蛋白（图4）；Lowry法测定蛋白浓度后计算得出，1 L菌液诱导后获得的蛋白产量约为17.4 mg。

用Ad5-MAGPopt疫苗候选株免疫后的小鼠血清对纯化后的MAGP240-526蛋白进行Western印迹检测，在相对分子质量 40×103～50×103处有明显条带（图5）。

图2 PCR扩增4种截短型GP片段

2.3 ELISA分析抗原特异性

用纯化后的截短蛋白以2 μg/mL的浓度包被酶联板，对用Ad5-MAGPopt疫苗候选株免疫过的小鼠血清、猴血清进行ELISA检测，结果显示我们制备纯化的截短抗原能与马尔堡疫苗候选株激发的抗体发生特异性结合（图6）。其中小鼠血清本底水平较低，D450nm值低于0.1；而猴血清本底水平较高，D450nm值在0.6左右。

图3 SDS-PAGE分析截短蛋白的表达

图4 SDS-PAGE分析MAGP240-526Ni柱、Q柱纯化后样品

图5 纯化后MAGP240-526蛋白的Western印迹

图6 截短抗原MAGP240-526的ELISA检测

3 讨论

MARV具有极高的致死率，是潜在的生物战剂，目前世界上尚无批准上市的疫苗[6]。GP是MARV的主要抗原成分，也是疫苗研制的靶标抗原。由于MARV属于第四级危害微生物，与活病毒相关的操作必须在生物安全四级实验室中进行[7]，利用灭活病毒作为抗原进行疫苗的抗体水平评价是比较好的方法，而我国目前还不具备此条件，因此，需要构建重组MARV GP来进行马尔堡疫苗抗体水平的评价。

MARV GP表达于病毒包膜表面，介导病毒接触、进入宿主细胞。GP以三聚体形式存在，每个单体由GP1和GP2亚单位构成，GP1与GP2通过二硫键相连。其中GP1包含受体结合区和重度糖基化的粘蛋白区，而GP2则含有2段7个重复序列及跨膜结构域。病毒通过胞吞作用进入细胞，在内体中，GP经宿主细胞的组织蛋白酶剪切移除粘蛋白区和聚糖帽，使细胞能够与NPC1受体结合[8]。由于表达全长GP具有一定难度，因此在本研究中，为了易于可溶性表达及纯化，我们对GP序列进行亲水性分析，选择了4段亲水性良好的片段，构建了4个原核表达载体，经过诱导表达，SDS-PAGE分析，筛选出一个可溶性表达良好的片段MAGP240-526。将该蛋白进行大量表达，纯化时发现，仅经Ni柱纯化获得的蛋白纯度太低，不能用于后续ELISA评价实验，于是对纯化条件进行了摸索和尝试，最终发现经Ni柱纯化后，对收集峰进行稀释换液并用Q柱进行第二次纯化，得到的蛋白纯度较高，Western印迹和ELISA检测显示该蛋白具有良好的MARV GP特异性，可以用于后续的MARV GP抗体水平检测。

综上所述，本研究获得了MARV GP截短抗原MAGP240-526，可作为MARV疫苗免疫学评价的抗原，为马尔堡病毒的疫苗、抗体研发及评价奠定了基础。

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