靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的DNA适配体筛选

翟景勤 ，窦晓倩 ，王文宇 ，付洁 ，王宇光 ，宋海峰 1，

1.安徽医科大学，安徽 合肥 230032；2.军事科学院 军事医学研究院 辐射医学研究所，北京100850；3.军事科学院 军事医学研究院 生命组学医学研究所，北京 100850

适配体（aptamers）通过空间结构与靶分子特异性识别，主要采用指数富集配基系统进化（sys⁃tematic evolution of ligands by exponential enrich⁃ment，SELEX）技术[1-2]从单链寡核苷酸（ssDNA）文库中筛选获得。近年来有关适配体筛选方法的不断更新与应用，使得快速筛选获得目标适配体成为可能，加速了其在基础研究、临床治疗和诊断方面的转化应用[3-7]。适配体的功能类似于抗体，但又有其独特优点，如靶分子范围广、性质稳定，易于制备且制备周期短等[8-11]。此外，作为“抗体类似药”[9,12]，适配体逐渐被应用于靶向治疗药物的研究。与靶分子结合发挥生物活性的适配体可单独成药用于临床，除了适配体药物Macu⁃gen（哌加他尼那）已应用于治疗年龄相关性黄斑变性[13]外，目前还有几十种药物处于临床试验阶段。适配体除了以单药的形式应用外，还可以双适配体药物形式、适配体化疗药物偶联物的靶向化疗药物等形式，在肿瘤治疗中发挥重要作用。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1（glypican-1，GPC1）是硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteogly⁃cans，HSPGs）家族的一员,近年研究表明，其主要与乳腺癌、胰腺癌的发生发展密切相关。Matsuda等[17-18]的发现GPC1在乳腺癌中高表达，并且与多种肝素结合生长因子的促有丝分裂有关。此外，GPC1在慢性胰腺炎组织和正常胰腺组织中低表达，而在胰腺癌细胞以及邻近的成纤维细胞中高表达。胰腺癌异植瘤裸鼠模型中，抑制GPC1的表达可以显著抑制肿瘤生长、血管生成能力以及转移能力[19-21]。另外，研究发现[22]胰腺癌患者体液中含有GPC1，富集在胰腺癌衍生的外泌体（GPC1+crExos）上，由于 GPC1+crExos的检测具有显著的特异性和灵敏性，所以可依据体液中GPC1+crExos水平的高低将慢性胰腺炎患者和早期与晚期的胰腺癌患者区分开来，同样在乳腺癌患者中也可观察到体液中GPC1+crExos的升高,因此GPC-1可作为新的肿瘤标记物，有利于早期肿瘤的发现。我们以GPC1为靶点，从ssDNA文库中筛选DNA适配体，为以GPC1适配体为基础的诊断和靶向治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293T细胞（ATCC细胞库）；Panc-1细胞系、乳腺癌ZR-75-1细胞系（北京协和细胞库）。设计并构建全长81 nt随机ssDNA文库及相应引物（ssDNA 文库：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCT CAA-38n-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′；文库上游引物primer1：5′-GGGAGCTCAGAATAAACG CTCAA-3′；文库下游引物 primer2：5′-GCTCAGA ATAAACGCTCAA-3′；文库下游引物 primer3：5′-Biotin-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3′。 文 库 及引物均由上海生工生物公司合成）。

荧光定量试剂盒（天根生化公司）；重组人GPC1蛋白（云克隆公司）；慢病毒包装载体pLP1、pLP2、VSV-G（Invitrogen公司）；pMD-GPC1质粒（北京义翘神州公司）；pCDH-CMV-MCS-EF1-Pu⁃ro质粒（System Biosciences公司）；pGL4.50［luc2/CMV/Hygro］质粒、萤光素酶检测试剂盒（Promega公司）；转染试剂MegaTran 1.0（OriGene公司）；TMB底物显色试剂盒（康为世纪公司）；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、无胰酶消化液（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；兔抗人GPC1、抗体羊抗兔IgG（Abcam公司）；TaqDNA聚合酶（博迈德生物技术公司）；短片段胶回收试剂盒（百泰克生物公司）；磁力架、镍离子螯合磁珠、链霉亲和-生物素磁珠（海狸生物医学工程公司）；蛋白磁珠结合缓冲液（20 mmol/L Na3PO4，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH7.4）；咪唑洗脱 液（20 mmol/L Na3PO4，50 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH7.4）；链霉亲和素-生物素磁珠缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，0.01%～0.1%Tween-20，pH7.4）；磷酸盐缓冲液（PBST，50 mmol/L K2HPO4，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween-20，pH7.5）。

LightCycler 96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；HulaMixer样品混合器（Life公司）；离心机、CO2培养箱（Thermo公司）；凝胶图像分析系统（上海天能科技公司）；超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）；生物安全柜（北京东联哈尔公司）；细胞自动计数仪（Count Star公司）；DSY5000X荧光显微镜（重庆澳浦光电公司）；流式细胞仪（BD公司）。

1.2 Luc-ZR-75-1GPC1稳定细胞系的构建

将pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体双酶切获得线性化pCDH载体，分别以pGL4.50和pMDGPC1质粒为模板，扩增萤光素酶基因片段和GPC1基因片段，并将片段与线性化pCDH载体进行酶连，获得重组质粒pCDH-EF1-GPC1-CMVLuc2-T2A-Pur（pEGCL），即人GPC1蛋白和萤光素酶共表达质粒。用MegaTran 1.0转染试剂将该重组质粒与质粒pLP1、pLP2、VSV-G按说明书混合后转染HEK 293T细胞进行慢病毒包装，12 h后换液用含2%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基继续培养60 h，收集含有慢病毒的细胞上清，并以1∶1的比例与含10%FBS的RPMI 1640培养基混合培养ZR-75-1细胞，48 h后用含嘌呤霉素与10%FBS的RPMI 1640培养基进行压力筛选。

1.3 Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1细胞系表达鉴定

1.3.1 GPC1表达鉴定 将培养的Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1细胞分别用细胞消化液消化至单细胞悬液，计数后按每管 1×106分装，用 100 μL PBS重悬，加入兔抗人GPC1抗体孵育1 h，PBS洗2次，100 μL PBS重悬后加入羊抗兔IgG孵育30 min，PBS洗2次，400 μL PBS重悬后进行流式细胞检测。

1.3.2 Luc-ZR-75-1GPC1细胞荧光素酶表达鉴定ZR-75-1、ZR-75-1pCDH-GFP、Luc-ZR-75-1GPC1细胞分别以100 μL（5×104/孔）接种至 96孔板，在 CO2细胞培养箱中培养12 h，将萤光素酶检测试剂盒中的冻干粉底物与缓冲液混合，100 μL/孔加入96孔板中，反应5 min，于酶标仪中检测荧光。

1.4 SELEX筛选

1.4.1 磁珠蛋白制备 用1.25 mL结合缓冲液重悬150 μL镍离子螯合磁珠，加入GPC1蛋白（或反筛蛋白Her3-ECD）20 μg，4℃旋转结合1 h，用PBST洗涤磁珠3次，加入200 μL PBST保存于4℃，蛋白终浓度为0.25 μg/μL。

1.4.2 GPC1蛋白筛选 将1 nmol ssDNA溶于100 μL PBST中，95℃热解变性 5 min后立即置于冰上冷却5 min，取GPC1蛋白磁珠（每轮筛选蛋白浓度见表1）与文库于10 mL PBST（含1 μg/mL牛血清白蛋白）中室温旋转结合30 min，置磁力架上分离，用500 μL PBST洗涤蛋白磁珠3次，加入15 μL洗脱液，取适量洗脱液作为模板进行qPCR扩增。

1.4.3 Her3-ECD蛋白反筛 ssDNA与反筛蛋白Her3-ECD在1 mL PBST中室温旋转孵育30 min，置磁力架上磁性分离，收集结合液，用酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，无水乙醇沉降ssDNA后溶于20 μL无菌水，作为模板进行qPCR扩增。

1.4.4 qPCR扩增 反应体系20 μL包括荧光定量混合液10 μL、引物（primer1+primer3，10 nmol/L）0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8.5 μL。反应条件为 95℃预变性 900 s，然后以 95℃变性 10 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s行15～25个循环，融解曲线分析后37℃持续30 s。

1.4.5 ssDNA文库制备 经扩增有生物素标记的dsDNA在链霉亲和素-生物素磁珠缓冲液中与链霉亲和素-生物素磁珠室温旋转结合1 h，用500 μL链霉亲和素-生物素磁珠缓冲液洗涤磁珠3次，用50 μL NaOH溶液与磁珠于37℃孵育15 min使dsDNA变性解链，收集含ssDNA的NaOH溶液，加入1 mL PBST后用10 mmol/mL磷酸二氢缓冲液调节pH值为7.5后保存，或直接投入下一轮筛选。进行4轮共10次筛选，包括2轮反筛，且ssDNA文库与蛋白磁珠的孵育时间、扩增的反应循环数随筛选的进行逐渐减少，而清洗蛋白磁珠的时间相对延长。

1.5 克隆与测序

将最后一轮筛选得到的适配体文库用引物primer1+primer2和TaqDNA聚合酶扩增，扩增产物回收纯化后与T4载体酶连并进行转化，挑选克隆，菌液PCR鉴定，挑选阳性克隆测序。用DNA⁃MAN软件分析适配体的二级结构。

表1 SELEX筛选蛋白浓度流程表

1.6 适配体ELISA亲和力鉴定

将GPC1蛋白用包被缓冲液进行浓度梯度稀释，100 μL包被于酶标板中4℃过夜；弃去孔内液体，用 300 μL PBST 洗板 5次，加入 100 μL 含1%BSA 的 PBST封闭 3 h；300 μL PBST洗板 5次，加入100 μL PBST稀释的5′端生物素标记的适配体室温结合1 h；300 μL PBST洗板5次，加入100 μL PBST稀释的二抗SA-HRP室温孵育30 min；300 μL PBST洗板5次，用TMB底物显色试剂盒室温显色25～30 min；加入2 mol/L H2SO450 μL后于酶标仪上测定D450nm值；选择软件Ori⁃gin 75，根据浓度梯度与吸光度值拟合亲和力曲线，记录亲和力常数Kd，并分析适配体的亲和力。

1.7 流式鉴定适配体特异性

同上流式细胞处理步骤进行Panc-1、Luc-ZR-75-1GPC1和HEK293T流式细胞的准备，将200 pmol的5′端FITC标记的适配体分别加入细胞悬液中孵育1 h，清洗重悬后进行流式细胞检测。

1.8 统计学分析

采用Excel的Student-t-test软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，2组间比较采用学生t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，所有试验均重复3次。

2 结果

2.1 pEGCL重组质粒鉴定

对pEGCL重组质粒用限制性内切酶双酶切（图1A）鉴定和测序比对（数据未示），表明CMVLuc2和GPC1基因以双启动子（EF1和CMV）串联形式构建入pCDH-EF1-GPC1-CMV-Luc2。基于流式细胞术对Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1细胞系表面GPC1表达鉴定见图1B，Panc-1和稳转Luc-ZR-75-1GPC1细胞系GPC1抗原阳性率分别为77.7%和86.14%，而阴性对照293T组的GPC1抗原表达低（2.77%），说明Panc-1和稳转Luc-ZR-75-1GPC1细胞系表面均表达GPC1抗原，可用于后续实验。荧光素酶基因报告实验中，稳转pEGCL质粒的Luc-ZR-75-1GPC1细胞在裂解后加入底物荧光素检测到生物荧光，荧光值为1 224 872 RLU，而不含萤光素酶基因的ZR-75-1细胞和转染pCDH-GFP的ZR-75-1细胞（ZR-75-1pCDH-GFP）的荧光值分别为1751和2021 RLU，远远低于Luc-ZR-75-1GPC1细胞的荧光值（P＜0.001），表明稳定转染的Luc-ZR-75-1GPC1细胞系同时有效表达萤光素酶，为后续体内活体GPC1 ssDNA适配体靶向成像研究奠定了基础。

2.2 适配体二级结构预测

经过10轮筛选，挑出24个阳性克隆进行测序，长度81 bp的有效ssDNA序列为23条。运用DNAMAN软件对适配体进行二级结构分析，适配体可分为5类，第1类（#1、#4、#5、#7、#8、#10）适配体的二级结构特征为富含内环的双链（图2A）；第 2类（#2、#3、#11、#16、#22）适配体是以小环为中心外连若干茎环（图2B）；第3类（#6、#12、#13、#14、#15、#17、#20、#24）适配体结构特征为不稳定大环两端为茎环（图2C）；第4类（#9、#21）适配体5′和3′端近端附近均形成茎环，随机序列区为富含内环的双链（图2D）；第5类（#18、#19）适配体随机序列部分与5′端及3′端形成多个内环并依据力的作用相互靠近（图2E）。

2.3 适配体与GPC1的亲和性与特异性鉴定

图1 pEGCL重组质粒构建和表达鉴定

从上述5类适配体中各选出1条（#6、#11、#9、#10、#18）进行FITC标记和生物素标记合成，通过ELISA分析，根据蛋白浓度进行亲和力曲线模拟，亲和力较好的为#9适配体（图3A，#9适配体的Kd=44±0.69 nmol/L），#6、#11、#10、#18适配体解离常数均为100～160 nmol/L。图3B为#9适配体与阳性组GPC1蛋白和阴性对照组Her3-ECD、空白对照及牛血清白蛋白（BSA）的结合D值，阳性对照组与阴性对照组相比具有显著性差异，说明筛选的适配体在GPC1蛋白水平上具有较高的亲和力。通过流式细胞术验证适配体对Panc-1、Luc-ZR-75-1GPC1细胞系结合的特异性，结果以#9适配体与2种细胞的亲和力最强，阳性率分别为44.69%和51.44%（图3C），其他几条适配体与2种细胞系的阳性率均为20%-40%，适配体与GPC1阴性细胞系ZR-75-1和HEK 293T的结合率为5%以下。说明筛选出的GPC1适配体与Panc-1、Luc-ZR-75-1GPC1细胞系具有良好的特异性。

3 讨论

GPC1在胰腺癌及乳腺癌中高表达，可作为肿瘤的生物标志物，在早期癌症诊断中发挥重要的作用[22]，因此，我们筛选靶向GPC1的适配体。本实验室胰腺癌Panc-1细胞系有效表达GPC1，而乳腺癌ZR-75-1细胞系GPC1抗原表达低，考虑到后续GPC1适配体在细胞水平和体内水平的功能研究，我们构建了人GPC1蛋白和萤光素酶共表达质粒，用慢病毒包装的方法获得稳定的Luc-ZR-75-1GPC1细胞系。Luc-ZR-75-1GPC1细胞系同时也表达萤光素酶，此细胞株适用于后续动物体内活体成像肿瘤模型，可用于靶向GPC1适配体与Luc-ZR-75-1GPC1肿瘤的共定位，也是肿瘤体内生长、治疗及转移相关研究的理想肿瘤模型。

图2 适配体二级结构预测

图3 候选适配体与GPC1结合亲和力和特异性

以GPC1为靶点筛选具有特异性和亲和力的适配体，经过10轮筛选，适配体得到了富集，获得一条与Panc-1和Luc-ZR-75-1GPC1细胞系都具有特异性和亲和力的适配体，但其构效关系仍有待进一步研究确证。筛选得到的适配体在细胞水平流式验证结果略低于商品化抗体结合率，这可能与筛选压力不足有关，也可能与筛选所用GPC1蛋白与细胞表达GPC1蛋白构象差异以及适配体未经修饰有关。

适配体的筛选是一个严格的过程，为得到亲和力更高的适配体，须对筛选流程进一步完善。初始文库的局限性、筛选过程中非特异性适配体及副产物的累积，以及结束筛选的指示标准都与适配体筛选的成功与否有关[23]。降低非特异性适配体的策略有：①穿插不相关靶点的反筛：在筛选过程中不可避免地存在对单链寡核苷酸的非特异性吸附作用，随着筛选的进行，靶分子用量减少，与靶分子结合的适配体也逐渐减少，累积的非特异性适配体与特异性适配体同时扩增，但由于非特异性适配体量的优势使其成为优势扩增，这对适配体筛选是不利的，因此筛选过程中有必要穿插多次不相关靶点的反筛，以除去非特异性适配体；②优化PCR反应和程序：SELEX筛选过程中最重要的是PCR扩增适配体阶段，循环数多会导致非特异性扩增，引物与模板的比例也起重要作用，在一般适配体PCR扩增阶段，经常会发生2条链两端互补或部分交叉互补从而形成异源双链DNA[24-25]，异源双链DNA的存在会促进杂交产物的形成，可能会导致文库的异常及缺失，所以适配体都是以相对低的循环数在模板浓度较低的情况下进行PCR扩增，因此目前较为新颖的扩增方法是ddPCR技术，可以通过形成数万个独立微滴使各个微小反应体系分别进行，减少模板DNA间的相互干扰，在一定程度上减少了异源DNA的生成，也还可以通过增加反应循环数来提高适配体产量；③次级文库ssDNA的制备方法也直接影响库的容量和质量：经典的制备ssDNA方法是不对称PCR技术，但由于PCR扩增存在优势扩增，进一步的PCR可能导致亲和力较高的适配体的损失。近些年磁珠法制备ssDNA文库的方法被广泛应用，生物素标记的双链DNA可以和链霉亲和素磁珠偶合，在强碱条件下使dsDNA解链变性，磁性分离收集碱液中的ssDNA文库，这种方法简化了制备ssDNA的过程，但由于过程中强碱的存在，ssDNA可能会发生部分降解，同样有适配体库的损失。λ外切酶[26]可以消化dsDNA成单链，对5′单端磷酸化标记的dsDNA比未标记的dsDNA消化速度高至少20倍，且对ssDNA的消化速度远远不及dsDNA，因此λ外切酶可用于制备次级文库ssDNA，并且制备过程中具有特异性，更有效地防止适配体的丢失。随着适配体筛选技术的不断完善，可以快速筛选出高亲和力高特异性的适配体，这对于推动适配体在分子识别技术及临床中的应用无疑是一种更加有效的工具。

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