高敏化学发光法测定丙肝病毒抗体的临床性能评价

石玉玲，谢思，许蔓春，廖扬，张卫云，陈建芸

广州军区广州总医院 检验科，广东 广州 510010

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是严重威胁人类健康的病原体之一，已成为全球性的公共卫生问题[1]。据WHO报告，全球约1.7亿人感染HCV，感染率约为3%，每年新增感染者约300～400万，死亡25万例[2]。我国HCV平均感染率约为3.2%[3]，感染者约3800万人，且近年来发病率呈上升趋势[4]。研究发现80%的HCV患者因早期诊断和治疗不及时发展成为慢性肝炎，约10%最终发展为肝硬化甚至肝癌[5]。作为传染性疾病，实验室诊断水平对丙肝的诊断和预防具有重要意义，早期诊断并及时治疗是防止病毒传播的有效手段。自从1989年建立了抗-HCV检测方法以来，丙型肝炎的检测技术就处于不断发展中。目前，抗-HCV IgG实验室检测方法主要有胶体金法、酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光法、重组免疫印迹法（RIBA），而不同的方法学检测HCV的特异性和灵敏度往往存在较大差异。并且，由于HCV核酸和蛋白变异很大，试剂的抗原包被并未包含所有HCV的基因区，因而有造成漏检的可能[6]。因此，如何选择灵敏、准确、及时的检测方法，对于HCV的诊疗具有重要的临床意义。我们对Sysmex HISCL-5000化学发光酶免疫仪的检测性能进行了分析评价，并对不同的检测HCV方法做对比分析，找出提高丙肝诊断率尤其是早期诊断率的更好的实验室检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

采集广州军区广州总医院2014年11月～2015年2月住院、门诊HCV患者清晨空腹血液标本826例，HCV诊断符合2004年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、中华医学会肝病学分会联合修订的《丙型肝炎防治指南》的有关标准[7]。标本经3000 r/min离心5 min分离血清后立即检测。

Sysmex HISCL-5000高敏发光全自动免疫分析仪及配套试剂；HCV质控品；HCV校准品（批号05424818）；雅培ARCHITECT i2000微粒子化学发光全自动免疫分析仪及配套试剂；Mikrogen公司的RIBA试剂盒；BBI Diagnostics的HCV血清转化盘；ADC600 ELISA全自动酶免疫分析仪及配套试剂。

1.2 精密度试验

精密度是在规定条件下重复检测样本的结果一致程度，是检测系统基本分析性能的指标之一[8-10]。通过批内和批间变异进行精密度评价[11]，参考CLSI的EP15-A2文件[12]。批内精密度试验，选取高、低3个浓度水平，充分混匀，对每个水平重复测定20次。批间精密度试验，选取高、低2个浓度水平，充分混匀重复10 d，每天每个水平重复测定2次，共20次。

1.3 一致率试验

选取临床血清标本826例，分别用HISCL-5000和雅培i2000SR检测HCV，计算阴、阳性一致率及总一致率。同时与科华ELISA检测弱阳性及弱阴性标本对比。对于不一致的结果进行确认，先对样本进行复查：复查后如仍不一致，须经RIBA试验确认。

HCV RIBA试验步骤：①将反应条放置在试剂盒的反应盘10个槽内，每个长形反应槽内均有一条正面朝上的反应条，在每个反应槽内加入2 mL待用缓冲液，反应条完全浸没后加入20 μL质控或8个不一致标本，置于振荡器上孵育摇晃3 h；②快速准确地倒掉液体，接着用缓冲液每隔3 min清洗1次，共清洗5次；③每个槽内加入2 mL第二抗体，置于振荡器上孵育摇晃45 min；④倾倒液体后进行清洗，步骤同②；⑤加入酶结合物TMB 1.5 mL孵育8 min；⑥用去离子水细流冲洗至少3次，室温放置10 min，显色判断结果。

1.4 临床特异性与临床灵敏度

1.4.1 特异性 选取713例阴性样本、101例干扰样本，分别用HISCL-5000和ARCHITECT i2000检测，判断临床特异性。

1.4.2 灵敏度 选取阳性标本111例，分别用HISCL-5000和ARCHITECT i2000检测，判断临床灵敏度。

1.5 干扰试验

测定HCV时，用检测RF、CMV、EB、TP、ANA、溶血、脂血等病原体感染者或正常人样本检测时不应出现阳性。本次实验单独选取相关疾病阳性样本，包括ANA 17例、EB 17例、RF 5例、CMV 31例、TP 16例、脂血5例、溶血5例、妊娠5例，总计101例。

1.6 血清转化盘

用2种仪器进行HCV由阳到阴血清转化比对试验，以判断结果的窗口期。血清盘分别取自志愿者病人的疾病不同时期的4管血清。

1.7 统计学处理

采用IBMSPSS 19.0和Excel统计软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 HISCL-5000分析仪精密度验证

批内精密度实验见表1，批间精密度实验见表2。

2.2 一致率试验结果

选取标本826例，分别在HISCL-5000和雅培i2000上测试，分析一致率，结果如表3，阴性一致率为99.0%，阳性一致率为92.5%，总一致率为99.0%。阳性比对中，有5例样本HISCL检测为阴性，将不一致标本用RIBA试剂进行确认，结果为2例不确，3例阴性；阴性对比中，有3例样本HIS⁃CL检测为阳性，将不一致标本用RIBA试剂进行确认，结果为2例阴性，1例阳性。确认实验4例支持HISCL-5000结果，2例支持i2000结果。

表1 HISCL-5000批内重复性及精密度

表2 HISCL-5000批间重复性及精密度

表3 HISCL-5000与i2000 HCV的一致率

选取弱阳性及弱阴性标本共172例，分别用HISCL和科华ELISA测试，分析一致率，结果如表4，阴性一致率为97.3%，阳性一致率为93.9%，总一致率为95.3%。8例样本检测不一致，其中2例HISCL检测为阴性，ELISA检测为阳性，将不一致标本用雅培i2000和RIBA进行确认，确认结果为阴性；有6例样本HISCL检测为阳性，ELISA检测为阴性，将不一致标本用雅培i2000和RIPA3.0进行确认，确认结果为5例阳性，1例阴性。确认实验7例支持HISCL5000结果，1例支持科华ELISA结果。

2.3 临床特异性与临床灵敏度评估

2.3.1 特异性 选取713例阴性样本（包含干扰样本101例）用HISCL-5000检测，判断各种方法的临床特异性。HISCL-5000检测出711例阴性，临床特异性达99.7%；雅培i2000检测出710例阴性，临床特异性为99.6%；ELISA检测出690例阴性，临床特异性为96.8%。

2.3.2 灵敏度 选取阳性标本111例用HISCL-5000检测，判断各种方法的临床灵敏度。HISCL-5000检测出111例阳性，临床灵敏度达100.00%；i2000检测出110例阳性，临床灵敏度达99.1%；ELISA检测出105例阳性，临床灵敏度达94.6%。

2.4 血清转化盘检测

血清转化盘购自ZeptoMetrix公司（Hepatitis C Seroconversion Panel，PHV913），检测结果见表5。HISCL-5000（＞1.0为反应阳性)与雅培i2000（＞1.0为反应阳性）两者都能很好地检测出HCV由阳到阴的转化，准确度得到验证，同时也表明2种仪器均具有良好的灵敏度。血清转化盘试验能及时发现此疾病的治疗变化，其他相关肝脏疾病同理也可根据此结果辅助治疗。

表4 HISCL-5000与ELISA法HCV一致率结果

表5 6542血清转化盘检测结果

2.5 结果分布图

根据826例样本检测结果绘制分布图（图1～3）。HISCL-5000测量结果中，92.2%阴性样本的C.O.I＜0.1，92.2%阳性样本的 C.O.I＞3.0；雅培 i2000测量结果中，77.0%阴性样本的 C.O.I＜0.1，88.1%阳性样本的 C.O.I＞3.0。

3 讨论

丙型肝炎病毒是丙型病毒性肝炎的病原体，丙肝是以肝脏损害为主的一组全身性传染病，急、慢性丙肝患者及无症状携带者是丙肝主要传染源，输血、针刺、吸毒是丙肝主要的传播途径。其急性感染期症状不明显，自然转阴率非常低，病程容易迁移，临床疗效差，效果不理想，目前还没有较好的疫苗及药物治疗此疾病。感染过程中常存在不同程度的肝功能损害并呈进行性加重，长期延误诊断和治疗易转变为肝硬化甚至发展为肝癌[13]。10.0%～20.0%的HCV感染者在感染20年后发展为肝硬化，1.0%～3.0%在感染30年后发展为肝癌[14]。我国属于丙肝高发区域[15]，加强对丙肝患者的早期诊断和筛查，提高HCV患者早期诊断率是临床治疗和控制疾病传染的关键。

HCV抗体检测是目前应用最广泛的流行病学调查和临床HCV筛查方法，可为HCV的早期发现和治疗提供可靠依据[16]。目前抗-HCV的检测方法主要有ELISA与化学发光法。ELISA是最常用的方法，第3代ELISA检测试剂增加了NS5区蛋白抗原，联合HCV核心抗原、NS3和NS4抗原，使抗体的覆盖率明显提高，检测敏感性和特异性也得到提高[17]。但ELISA法需要复杂操作步骤和批量检测，费时费力。现阶段，临床上多使用美国雅培ARCHITECT化学发光仪检测HCV抗体。本研究中，我们采用日本Sysmex HISCL-5000测定血液样本中的HCV抗体。Sysmex HISCL-5000采用高敏发光底物的化学发光酶免疫法，具有反应时间短（17 min）、样本量少（10～30 μL）、脱磁清洗、干扰物影响少等优点。通过两步法形成链霉素亲和素包被的磁珠-生物素化的单克隆抗体-待测血清标本-碱性磷酸酶标记单克隆抗体的复合体，最后加入发光底物CDP-Star，根据其发光强度计算浓度。生物素-亲和素相互作用具有高特异性、高敏感性；双抗体夹心法中用酶标记抗体催化发光底物可使免疫反应的结果得以放大，提高灵敏度；CDP-Star是通过二氧戊烷在碱性磷酸酶的激活作用下以持续的速度发出光信号来进行检测，灵敏度高，发光时间从几分钟开始可以延续数天，所以可多次曝光时间并对曝光时间进行优化，是目前最快速、最灵敏的化学发光底物，曝光时间只需15～60 s。通过反复冲洗进行B/F分离（脱磁清洗），能获得高于以往仪器的冲洗效果，减少非特异物质和还原背景。

图1 HISCL-5000检测结果频数图

图2 i2000检测结果频数图

图3 ELISA检测结果频数图

精密度检测表明Sysmex HISCL-5000的重复性较好，测定结果稳定。血清HCV抗体出现较晚，抗体转阳一般有一个约70 d的较长窗口期，部分患者甚至可长达5～8个月[18]，部分患者在感染治愈或康复后仍可持续阳性，HISCL可检测出HCV由阳到阴血清转化，且HISCL使用转化血清盘检测比雅培ARCHITECT提前1周测定出由阴转阳的血清转化，检测窗口期提前1周，缩短了HCV感染诊断的窗口期，使抗病毒治疗检测成为可能，表明该检测方法具有高的准确度。HISCL与雅培i2000的总一致率为99.0%，对不一致结果用RIBA进行确认，结果表明HISCL-5000具有较好的准确度。与科华ELISA试剂的总一致率为95.3%，HISCL-5000的阳性检测率高于ELISA。这可能与HISCL-5000检测大大缩短了HCV感染诊断的窗口期有关。综上所述，HISCL-5000适于丙肝临床筛查，检测效果好，值得进一步推广。

[1] 陈攸涛,江家骥.丙型肝炎病毒流行现状[J].海峡预防医学杂志,2009,15(5):19-21.

[2] 李杰,庄辉.病毒性肝炎流行病学进展[J].肝脏,2012,17(1):2-5.

[3]窦晓光,丁洋.慢性丙型肝炎抗病毒治疗的新策略和新方法[J].中国实用内科杂志,2010,30(3):217-219.

[4] 刘学芝.东兴区2003-2011年丙型病毒性肝炎流行特征及趋势分析[J].中外健康文摘,2013,(5):69-71.

[5] Kesli R,Polat H,Terzi Y,et al.Comparison of a newly developed automated and quantitative hepatitis C virus(HCV)core antigen test with the HCV RNA assay for clinical usefulness in confirming anti-HCV results[J].J Clin Microbiol,2011,49(12):4089-4093.

[6] Valcavi P,Medici M C,Casula F,et al.Evaluation of a total hepatitis C virus(HCV)core antigen assay for the detection of antigenaemia in anti-HCV posi⁃tive individuals[J].J Med Virol,2004,73(3):397-403.

[7]中华医学会肝病学分会,中华医学会传染病与寄生虫病学分学.丙型肝炎防治指南[Z].2004.

[8] 刘欧,徐国宾,王兰珍,等.6个检测系统4种分析方法测定人血清葡萄糖的精密度和正确度调查[J].临床检验杂志,2010,28(3):227-229.

[9] 欧阳能良,王伟佳,李飞,等.应用CLSI EP-A2文件评价BNP和NT-proBNP测定的精密度性能[J].国际检验医学杂志,2011,32(5):538-540.

[10]温冬梅,张秀明,吴剑杨,等.应用CLSI EP5-A2文件评价生化检测系统的精密度性能[J].检验医学与临床,2010,7(19):2096-2098.

[11]Wang H,Guo P,Sun H,et al.Molecular epidemiolo⁃gy of clinical isolates of carbapenem-resistant Acineto⁃bacter spp. from Chinese hospitals[J]. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(11):4022-4028.

[12]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of preci-sion performance of quantitative measurement methods[S].EP15-A2,CLSI,2004.

[13]Temesgen Z,Talwani R,Rizza S A.Sofosbuvir for the treatment of chronic hepatitis C virus infection[J].Drugs Today(Barc),2014,50(6):421-434.

[14]匡国杰,武洪文,肖漓.单中心两种方法检测280例群体反应性抗体的对比分析[J].中国组织工程研究,2014,5(12):767-772.

[15]舒玲,李露瑶,马莹.丙肝病毒抗体检测结果的分析与解读[J].现代预防医学,2014,2(6):300-303.

[16]张言超,陈明,李强,等.HCV RNA和抗-HCV联合检测的诊断意义[J].徐州医学院学报,2010,30(8):536-537.

[17]Wang T Y,Kuo H T,Chen L C,et al.Use of poly⁃merase chain reaction for early detection and manage⁃ment of hepatitis C virus infection after needle stick injury[J].Ann Clin Lab Sci,2002,32(2):137-141.

[18]Swellam M,Mahmoud M S,Ali A A.Diagnosis of hepatitis C virus infection by enzyme-linked immuno⁃sorbent assay and reverse transcriptase-nested poly⁃merase chain reaction:a comparative evaluation[J].IUBMB Life,2011,63(6):430-434.