发酵蜣螂粉乙醇提取物抗肿瘤活性研究

曹广超,王彦多,刘 颖,李亚男,刘金虎,桑 晓,毛会秀,王集会,史 磊*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

蜣螂是鞘翅目金龟子科昆虫屎壳螂Catharsius molssus L.的干燥全虫[1]，在我国药用历史悠久，蜣螂作为传统中药材，其体内含有蜣螂毒素，能破症结，通二便，定惊痫﹑拔毒生肌﹑散肿止血[2]。临床上在治疗小儿厌食症，粘连性肠梗阻，输尿管结石，肝硬化腹水方面临床效果称奇[3]。现在药理学对蜣螂的研究，主要集中于抗前列腺炎、抗前列腺增生以及抗炎等的方面[4-6]，而在其疗效好抗肿瘤方面的研究相对较少。仅在黄显章等对蜣螂的醇提取物进行人体肝癌细胞实验的研究中发现，蜣螂对肝癌的抑制作用有显著的效果[7]。

本次实验，我们采用优化后的提取工艺提取发酵蜣螂醇提物，旋蒸后得发酵蜣螂的乙醇提取物，选择有代表性的肿瘤细胞如乳腺癌细胞(MCF-7)、肺腺癌细胞(A549)进行体外抗肿瘤活性评价。为蜣螂在临床上的应用及发现新的抗肿瘤药物提供新的研究思路。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UV9100B型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；ST 16R高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；DLSB-ZC低温循环真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；FA1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);六两装高速万能粉碎机(浙江屹立工贸有限公司);远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)；EL340i型全自动酶标仪(Molecular Davices);Memmert CO2培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)。

1.2 试剂

芸香叶苷 三水(国药集团化学试剂有限公司，批号:20170426);RPMI-1640培养基、胰酶(上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；MTT。

1.3 供试品

药材蜣螂购自安徽省亳州市中药材市场, 经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为蜣螂虫Catharsius molossus L.的干燥体(批号：20170502)。

1.4 实验细胞

肺腺癌A549细胞株、乳腺癌MCF-7细胞株均由山东省立医院提供。

2 方法

2.1 药材前期处理

将蜣螂经清水漂洗后沥干，放入冷冻室冷冻后匀浆，在冷阱-60℃，室温真空状态下冷冻干燥至粉末状，得蜣螂冻干粉。

2.2 发酵蜣螂粉的制备[8]

称取适量的蜣螂冻干粉，按1∶1比例加入活的白僵菌孢子粉(100亿/g，山东省农业科学院自筛菌株-桃5)，再加入少量吐温-80，用适量灭菌水将其稀释成1×108的混悬液，搅拌均匀后，转移至恒温恒湿培养箱中，在温度为25～28 ℃，湿度为95 %的条件下发酵8h左右，直到长满菌丝后便停止发酵，将其取出冷冻保存，以作备用。

2.3 发酵蜣螂乙醇提取物的制备[9]

称取蜣螂冻干粉1.0000 g，加入圆底烧瓶中，按料液比1∶20加入80%的乙醇，在90℃条件下，乙醇回流提取两次共2.5 h，抽滤后3000 r/min下离心10 min，最后将上清液(发酵蜣螂乙醇提取液)置旋转蒸发仪中减压回收乙醇, 即得蜣螂乙醇提取物。取出装袋冷冻保存备用。

2.4 发酵蜣螂醇提物抗肿瘤活性研究

2.4.1 发酵蜣螂乙醇提物溶液的配制

精密称取10 mg发酵蜣螂乙醇提物，溶于5 mL 1640培养液中，配成2 mg/mL溶液。在超净工作台中用0.22 μm的滤膜进行过滤，然后用已滤菌的1640培养基依次稀释，配成1.6、1.2、0.8、0.4mg/mL浓度梯度的药物溶液。

2.4.2 抗肿瘤活性实验方法

将处于对数生长期的乳腺癌MFC-7细胞和肺腺癌A549，以每孔100 μL接种于96孔培养板，预留三个调零孔(调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞)置于37℃、5% CO2培养箱中培养。待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，调零组和空白对照组加100 μL的1640培养基(不含血清)，阳性对照组加100 μg/mL的顺铂100μL，其他给药组每孔分别加入不同浓度的药物100 μL，每个浓度的药物重复5个孔，其中以发酵蜣螂醇提液作为对照组。然后继续在37 ℃、5 % CO2培养箱中培养。24 h后，每孔加入5 mg/Ml MTT溶液20 μL于培养箱内避光反应4 h。吸去上清液，加入100 μL DMSO，用酶标仪于492 nm处测定吸光度值，然后按下式进行药物对细胞的抑制率的计算。

细胞抑制率(%)=[1-(加药组OD-调零组)/(空白组OD-调零组)]×100 %

3 结果

3.1 MTT法测定发酵蜣螂乙醇提取物抗肿瘤活性

采用MTT法检测不同浓度梯度下发酵蜣螂乙醇提取物对肺腺癌细胞A549、乳腺癌细胞MFC-7的抑制作用如表1所示。

组别A549细胞MCF-7细胞A492抑制率/%A492抑制率/%阴性对照0．361+0．001-0．317+0．001-发酵蜣螂乙醇提取物/(mg·L-1)0．40．250+0．00137．940．301+0．0016．210．80．263+0．00133．310．287+0．002b11．471．20．216+0．00149．580．220+0．00138．021．60．160+0．002a68．820．217+0．00139．122．00．146+0．002b73．730．111+0．00180．75

与阴性对照组比较，a：P<0.05，b:P<0.01。

为方便将不同浓度梯度下发酵蜣螂乙醇提取物对肺腺癌细胞A549、乳腺癌细胞MFC-7的抑制作用进行显著比较及趋势分析，列数据抑制率曲线如图1所示。横坐标为不同药物的浓度(mg/mL)，纵坐标为醇提液对A549和MCF-7的抑制率(%)。

图1 发酵蜣螂乙醇提取物对肺腺癌细胞A549、乳腺癌细胞MFC-7的抑制率
Fig.1 Inhibition ratio of the fermented Catharsius powders alcohol extracts on lung adenocarcinoma A549 and breast cancer MFC-7 cell

由图1可知，不同药物浓度对乳腺癌MCF-7和肺腺癌A549细胞具有较好的抑制作用，其IC50分别为1.51和0.94 mg/mL。随药物浓度的增加，对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率成梯度性上升，且在药物浓度小于1.6 mg/mL，其抑制效果不太显著；当药物浓度低于1.2 mg/mL时，对肺腺癌A549细胞的抑制率较弱，其后抑制效果随浓度的增加而增大。总体来说，在药物浓度低于1.6 mg/mL时，药物对肺腺癌细胞的抑制率比对乳腺癌细胞的作用强，但作用强度较小。当药物浓度超过1.6mg/mL时，对肺腺癌A549细胞和乳腺癌MCF-7具有很强的抑制效果，且作用强度后者大于前者。

4 讨论

虫类中药的发酵，在国内外研究报道鲜少，采用新型固态发酵技术对传统中药进行成分提取，也是对虫类中药研究的的重大变革。中药炮制就运用天然微生物发酵传统中药，有的可以提高中药药效，改变药性及降低毒副作用等效应。本次研究中使用球孢白僵菌对蜣螂粉进行真菌发酵,研究经发酵后蜣螂醇提物的药理活性，以期为蜣螂抗肿瘤新药物成分的提取，提供新的方法，其次也增强药物治疗效果。在发酵虫类中药的研究中，具有一定的前瞻性。

体外药理实验结果表明：通过采用新型固体发酵方式，有利于提高蜣螂有效成分的提出率。再经乙醇回流提取后，对肺腺癌A549细胞和乳腺癌MCF-7具有不同的抑制效果。低浓度时，抗肿瘤抑制效果较弱；当提高药物浓度，有利于药物通过被动转运进入细胞，使肿瘤细胞增殖受到抑制或产生细胞周期阻抑，进而达到抗肿瘤抑制效果。总体本次研究表明：发酵蜣螂醇提物对MCF-7和A549具有较好的抑制作用,且作用强度与药物浓度成正比。其次为体内蜣螂抗肿瘤药理实验的研究提供指导，有利于开发新的抗肿瘤药物为临床用药提供新思路。

[1] 南京中医药大学.中药大辞典[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006．

[2] 侯仙明,张书金,贾云芳,等.蜣螂古今应用研究[J].河北中医药学报,2014(2):42-44.

[3] 陈建军,刘立春.两种药用蜣螂虫的人工饲养及诱捕技术[J].南京农专学报,2001(4):44-48.

[4] Ahn M Y，Hahn B S，Ryu K S,et al.Purification and characterization of a serine protease: (CPM-2) with fbrinolytic activity from thedung beetles[J].Arch Pharm Res,2005,28(7):816-822．

[5] 赵兴梅,朱 敏,杨 明,等.蜣螂抗实验性前列腺增生作用研究[J].中药药理与临床,2006(5):37-38.

[6] 刘纯益.关于昆虫抗癌物质的研究概况[J].昆虫知识,1979(4):182

[7] 黄显章,丁生晨,袁 林,王 旭,郝鹏飞,张景景.蜣螂水提取物的镇痛抗炎作用[J].中华中医药学刊,2016(09):2191-2194.

[8] 焦方文,张盼盼,孙 静,等. 全蝎蛋白的超声提取工艺研究[J/OL]. 山东中医杂志,2016,35(09):824-825.

[9] 黄显章,丁生晨,袁 林,等. 蜣螂乙醇提取物的抗炎作用研究[J].中华中医药学刊,2017(4)：1002-1004.

(本文文献格式：曹广超,王彦多,刘颖，等.发酵蜣螂粉乙醇提取物抗肿瘤活性研究[J].山东化工，2018，47(02)：22-24.)