高灵敏度席夫碱镁离子荧光探针的合成及识别性能研究

吴红梅 郭 宇 曹建芳 陈强强

(辽宁工业大学化学与环境工程学院，锦州121001)

1 引 言

镁离子(Mg2+)是细胞中含量位居第二位的生物离子，具有十分重要的生理功能。Mg2+能够参与核酸和蛋白质的合成及能量代谢、 调控细胞的分化、 增强酶的催化功能，通过影响Ca2+和K+的转运调控传递信号，与细胞中的三磷酸腺苷(ATP)结合后在肌肉收缩和主动运输方面发挥重要的作用[1,2]。人体中Mg2+浓度的变化对细胞生理活动会产生重要的影响，并会引起一些疾病的发生[3,4]。因此， Mg2+的检测方法的研究在生理学、 营养学、 临床医学、 化学和环境学等领域具有重要意义。

目前，虽然金属离子的检测方法较多，但仍有一些问题尚待解决。EDTA络合滴定法不仅消耗试剂、 耗时费力，而且受其它金属离子干扰严重[5]。原子吸收法较为精确、 灵敏，但从机理上难以区分金属离子是以键合形式还是游离形式存在[6]。电子探针微量分析不能测定键合或自由金属离子浓度，只能测定干细胞内的离子浓度[7]。核磁共振法可以精确测定自由金属离子浓度，但无法得到金属离子在细胞内的分布信息[8]。相对于上述检测方法，荧光探针法以操作简便、 高灵敏度、 高选择性、 实时监测和原位成像等特点，逐步发展为金属离子检测的常用方法[9～13]。目前，已经发展了冠醚类[14]、 罗丹明类[15]、 香豆素类[16]、 二酮类[17]和喹啉类[18]等Mg2+荧光探针，然而，有些探针合成复杂; 此外，Mg2+和Ca2+化学性质相似，导致检测Mg2+时容易受到Ca2+干扰。因此，合成简单、 高选择性和高灵敏度的Mg2+荧光探针仍具有一定的挑战性和良好的实际应用价值。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Varian INOVA-400MHz核磁共振仪(美国Varian公司，TMS为内标); X-6显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司); HP8453紫外可见光谱仪、 HPLC-Q-Tof MS 型质谱仪(美国Agilent公司); JASCO FP-6500荧光光谱仪(英国Edinburgh Instruments公司); Elementar varioEL Ⅲ 元素分析仪(德国Elementar公司)。

2-羟基-1-萘醛、 4-氨基苯甲酸甲酯、 丹磺酰氯(分析纯，北京百灵威科技有限公司); 无水Na2SO4(分析纯，济宁百川化工有限公司); 三乙胺、 冰醋酸、 氯化亚砜、 水合肼、 乙酸乙酯、 甲醇、 丙酮、 乙醇、 乙腈、 二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、 乙醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司); 实验用水为去离子水。

2.2 镁离子荧光探针TZ的合成

镁离子荧光探针TZ的合成路线见图1。4-氨基苯甲酸甲酯和丹磺酰氯反应生成化合物A1(4-(1-(二甲基氨基)萘-5-磺酰胺基)苯甲酸甲酯)，A1再与水合肼作用生成A2(4-(1-(二甲基氨基)萘-5-磺酰胺基)苯甲酰肼)，最终A2与2-羟基-1-萘醛进行Schiff's bases反应合成了镁离子荧光探针TZ。

图1 镁离子荧光探针TZ的合成路线Fig.1 Synthetic route of fluorescent probe TZ for detection of magnesium ions

2.2.1化合物A1的合成称取5 g(33.1 mmol)4-氨基苯甲酸甲酯置于250 mL烧瓶中，加入60 mL二氯甲烷溶解，再加入适量三乙胺，利用恒压漏斗将溶解在二氯甲烷中的丹磺酰氯逐滴加入到上述溶液中，反应24 h后用水萃取，有机相经无水Na2SO4干燥后，旋转蒸发得到黄色粉末产品，产率50.13%。

2.2.2化合物A2的合成将化合物A1放入烧瓶中，加入过量的水合肼(80%)回流24 h，除去反应液得到油状物，将油状物用乙醚超声处理后得到黄色粉末，产率90.0%。

2.2.3镁离子荧光探针TZ的合成在冰醋酸催化下，将化合物A2与2-羟基-1-萘醛以1∶1.2的摩尔比在甲醇溶液中回流24 h，除去反应液得到黄色粉末产品，产率82.3%。熔点: 274.6℃～275.3℃; ESI-MS:m/z537.14归属于[TZ-H]-，m/z573.11归属于[TZ+Cl]-; 元素分析计算值: C，66.90%; N，10.40%; H，4.87%; 实验值: C，66.92%; N，10.36%; H，4.86%;1H NMR谱(d6-DMSO)，δ: 2.80 (6H，d)，7.25 (4H, m)，7.42 (1H, t，J(H, H)=7.6 Hz)，7.67 (3H, m)，7.79 (2H，d，J(H, H)=8.4 Hz)，7.93 (2H，m)，8.18 (1H, d,J(H, H)=8.8 Hz)，8.37 (2H, m)，8.48 (1H，d，J(H,H)=8.8 Hz)，9.39 (1H，HCH=N, s)，11.22 (1H，HSO2NH, s)，12.01(1H, HOH, s)，12.73 (1H, HCONH, s)。

2.3 光谱测试

2.3.1溶液的配制探针TZ溶液的配制: 首先配制1.0×10-3mol/L高浓度探针TZ的DMF溶液，然后用DMF-H2O(9∶1,V/V)稀释，得到用于荧光和紫外光谱测试的低浓度TZ溶液。

各种金属离子溶液的配制: 首先配制0.02 mol/L的高浓度金属离子溶液，根据测试需要用去离子水将其稀释到特定浓度。

2.3.2紫外光谱滴定移取2 mL 20 μmol/L探针TZ溶液加入到光程1 cm的比色皿中，然后用微量注射器由低倍数到高倍数逐步加入金属离子(总量少于100 μL)，测定300～600 nm波长范围的吸收光谱变化，直至平衡。

2.3.3荧光光谱滴定移取2 mL 1 μmol/L 探针TZ溶液加入到1 cm宽的比色皿中，用Mg(NO3)2溶液滴定(由低到高倍数，总量少于100 μL)，以400 nm的光激发，狭缝宽度为1 nm，测定400～700 nm范围内荧光发射光谱变化，直至平衡。

2.3.4量子产率测定采用的Rhodamine 6G[26](量子产率0.94，溶剂为乙醇)为参照测定荧光量子产率，TZ+ Mg2+的激发波长为400 nm。TZ+ Mg2+的量子产率通过公式(1)计算得出为0.57。

(1)

其中，φstd和φunk分别为参比标准样品和待测样品的荧光量子产率，Astd和Aunk分别为参比标准样品和待测样品在激发波长处的吸光度，Iunk和Istd分别参比标准样品和待测样品的归一化荧光强度，ηstd和ηunk分别参比标准样品和待测样品溶剂的折射率。

3 结果与讨论

3.1 TZ-Mg2+的电喷雾质谱(ESI-MS)分析

向探针TZ中加入硝酸镁后的电喷雾质谱图如图2所示， 质谱峰m/z593.3593归属为 [Mg + TZ + CH3OH]+;m/z625.3810归属为物种[Mg +TZ + NO3]+，与Isopro3.0program软件的模拟结果相吻合，说明探针TZ与Mg2+的螯合模式为1∶1，并且在溶液中能够稳定存在。

图2 向探针TZ中加入Mg(NO3)2的电喷雾质谱(ESI-MS)图Fig.2 Electrospray ionization mass spectrum (ESI-MS) of TZ in the presence of Mg(NO3)2

3.2 紫外光谱分析

图3为向探针TZ溶液(DMF-H2O(9∶1,V/V))中加入Mg2+的紫外滴定曲线。从图3可见，探针TZ在386.5 nm出现了较宽的吸收带，为2-羟基-1-萘醛的特征吸收，是萘醛π-π*跃迁的结果。当加入Mg2+后，在411 nm处出现新的吸收峰，并且吸收峰的强度逐渐增强，最后达到平衡，这主要是由于探针TZ与Mg2+配位后产生电荷跃迁的结果，等吸收点为400 nm，表明溶液中只有TZ和TZ-Mg两种物种共存。

图3 向探针TZ溶液(20 μmol/L)中加入不同浓度Mg2+的紫外-可见滴定曲线。 插图: (a) TZ与Mg2+配位的Job's plot图; (b) 平衡常数拟合曲线Fig.3 Absorption spectra of TZ (20 μmol/L) upon the addition of Mg2+ in DMF-H2O(9∶1, V/V). Inset: (a) Job's Plot analysis of TZ with Mg2+ in DMF-H2O(9∶1, V/V) solution; (b)the linear fitting curve of the UV-Vis titration at 411 nm

图3插图a为探针TZ与Mg2+配位的Job's plot 曲线图，保持探针TZ和Mg2+总浓度不变(20 μmol/L)，测定Mg2+与探针TZ不同比值时的紫外吸收强度，[TZ]/[TZ+Mg2+]=0.5处紫外吸收峰强度最大，说明TZ与Mg2+以1∶1的比例配位，这也进一步验证了ESI-MS谱图的结果。根据1∶1的配位比例，利用图3紫外滴定曲线中411 nm处的吸收峰强度数值, 通过Origin软件进行线性拟合(图3插图b)，计算出探针TZ与Mg2+配位的平衡常数为1.34×106L/mol。

3.3 荧光光谱分析

采用理论计算的方法进一步研究探针TZ对Mg2+的识别机制，如图6所示。所有的理论计算结果均利用高斯09软件完成，基态几何优化结构采用密度泛函理论方法，B3LYP泛函，6-31G(d，p)基组和PCM溶剂化模型并在水溶液中进行计算。实验数据显示，探针TZ识别Mg2+的信号主要来自2-羟基-1-萘醛发出的荧光。由图6可知，在加入Mg2+之前，2-羟基-1-萘醛存在PET过程，配位基团的LUMO能级恰巧介于2-羟基-1-萘醛的HOMO和LUMO能级之间，阻碍了2-羟基-1-萘醛LUMO轨道到HOMO轨道的电子回迁，不产生荧光; 当加入Mg2+后， 配位基团的LUMO能级升高，HOMO能级降低，使2-羟基-1-萘醛的LUMO轨道到HOMO轨道很容易发生电子回迁，PET过程消失，发出2-羟基-1-萘醛的荧光，实现了对Mg2+的识别。此理论计算结果与荧光测试结果(图4)一致。

图4 (A) 激发波长分别为350和400 nm时探针TZ的荧光发射光谱图; (B)在探针TZ(1 μmol/L)中逐渐加入Mg2+的荧光强度的变化，λex=400 nm。插图为Mg2+加入量与荧光强度的关系。Fig.4 (A) Fluorescent spectra of TZ at excitation wavelength of 350 and 400 nm in a solution of H2O/DMF (DMF-H2O(9∶1, V/V)), respectively, (B) Fluorescent responses of TZ upon addition of Mg2+ at excitation wavelength of 400 nm. Inset: influence of Mg2+ on the fluorescent intensity at excitation wavelength of 400 nm.

图5 荧光探针TZ识别Mg2+的PET过程示意图(X为配位的溶剂或阴离子)Fig.5 Schematic diagram of photoinduced electron transfer (PET) process of probe TZ for detection of Mg2+

3.4 探针TZ对Mg2+识别的线性范围和检出限

在1 μmol/L探针TZ溶液中逐渐加入Mg2+，Mg2+浓度在0.13～2.00 μmol/L区间与荧光强度呈良好的线性关系，如图7所示，线性回归方程为y=1.03997+2.1147x，线性相关系数R2=0.999，检出限(LOD)为0.13 μmol/L。Wang等[19]合成了色酮醛缩靛红类镁离子荧光探针，检出限为5.16×10-7mol/L，与其相比，本研究合成的探针TZ具有更高的灵敏度。

图7 Mg2+浓度与荧光强度的线性拟合图Fig.7 Linear fitting curve of the fluorescent intensity versus Mg2+ concentration upon addition of Mg2+ into TZ (1 μmol/L)

3.5 选择性测试

图8A为探针TZ对其它各种金属离子选择性测试的荧光光谱。向探针TZ (1 μmol/L)中分别加入20倍浓度其它金属离子，在468 nm处TZ仅对Mg2+具有特定响应，而对碱金属和碱土金属离子K+、 Na+、 Li+、 Ca2+及过渡金属离子Zn2+、 Mn2+、 Cd2+、 Pb2+、 Ag+和Cr3+等没有明显的响应，表明TZ对Mg2+具有十分优良的选择性，原因可归结为席夫碱探针TZ合适的配位构型，并且对Mg2+具有很强的螯合能力，络合常数较大。

在选择性实验的基础上进行了竞争性实验，首先取2 mL探针TZ (1 μmol/L)溶液放入比色皿中，分别加入20倍的Na+、 Li+、 K+、 Ca2+、 Zn2+、 Cd2+、 Ag+、 Pb2+、 Mn2+、 Cr3+等金属离子，在此基础上再加入10倍Mg2+，测定在468 nm处的荧光强度。如图8B所示，大量Na+、 Li+、 K+、 Ca2+、 Zn2+、 Cd2+、 Ag+、 Pb2+、 Cr3+和Mn2+共存时不影响探针TZ对Mg2+的检测。可见探针TZ能够高灵敏度、 高选择性的识别Mg2+，具有较强的抗干扰能力。

图8 (A)探针TZ (1 μmol/L)对不同离子(20 μmol/L)的选择性; (B)其它离子存在下探针TZ (1 μmol/L)对Mg2+的识别, 激发波长为400 nm。Fig.8 (A)Fluorescence emission of TZ (1 μmol/L) in DMF-H2O(9∶1, V/V)upon addition of different metal ions (Mg2+, K+, Na+, Li+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, Cd2+, Pb2+, Ag+, Cr3+, 20 μmol/L, respectively) and (B) fluorescence responses of TZ (1 μmol/L) in aqueous solutions of DMF-H2O(9∶1, V/V) to 10 μmol/L Mg2+ (20 μmol/L) in the presence of above various metal ions. Excitation wavelength is 400 nm.

4 结 论

设计合成了一种新型席夫碱类荧光探针TZ，研究了探针对镁离子的识别行为和机理。在各种金属离子中，探针TZ仅与Mg2+结合后在发射波长468 nm处荧光强度显著增强，增强约10倍， 量子产率高达57%，检出限为0.13 μmol/L，实现了对Mg2+的高灵敏度和高选择性识别，为进一步检测生物体内Mg2+的含量和分布等研究提供了依据。

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