淫羊藿苷对骨质疏松性老年骨折模型愈合过程的影响

邓 君 邱 波

(湖北第三人民医院急诊科，湖北 武汉 430000)

骨质疏松是一种与衰老密切相关的病理现象，临床以骨量减少、骨组织结构退化为特征，导致骨的脆性增高，增加骨折风险。骨质疏松性骨折是骨强度下降导致的骨折，是骨质疏松最严重的后果。据统计，55%骨质疏松发生于老年人，其中约10%会发生骨折，严重威胁老年人身心健康和影响生活质量〔1～3〕。淫羊藿具有补益肾阳、强筋健骨等功效，常用于骨质疏松、骨折后期等疾病〔4,5〕。淫羊藿苷是淫羊藿最重要的有效成分，对体内外的成骨细胞均能有效进行干预，并对骨间充质干细胞的表达、分化、凋亡有多层次的影响〔6～8〕。本文旨在探讨淫羊藿苷对骨质疏松性老年骨折愈合过程的影响。

1 资料与方法

1.1动物与药物 15月龄，体质量(530±20)g，SPF级SD大鼠90只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔合格证号：SCXK(京)2016-0064〕。淫羊藿苷(广州谷多生物科技有限公司)，溶于100 ml 0.9%氯化钠注射液，低温、避光保存。

1.2主要试剂与仪器 注射用青霉素钠(400万U/支，中诺药业有限公司)；骨保护素(OPG)，免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒、钙测定试剂盒、磷测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；苏木素-伊红、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(天津市申泰化学试剂有限公司)；OLYMPUS光学显微镜(日本)；NORLAND EXCELL双能X线吸收仪(美国NORLAND公司)；紫外光栅分光光度计752型(山东高密彩虹分析仪器有限公司)。

1.3方法

1.3.1骨质疏松性骨折大鼠模型制备 造模大鼠用维A酸以80 mg/kg进行灌胃，1次/d，连续灌胃3 w，建立骨质疏松模型；第4周时对大鼠进行骨密度检测，验证造模成功。所有造模大鼠35 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液进行麻醉，固定在手术板上，碘伏消毒，右后腿中段前外侧切口，人工造成右侧胫骨中上段骨折，将1 mm克氏针从胫骨近端至远端髓内固定，缝合伤口，造成骨质疏松性骨折模型，术后每日注射10万U青霉素钠，连续3 d。同时取30只SD大鼠，灌胃等量蒸馏水，同样方法只有手术切口，不损伤胫骨，缝合伤口，作为假手术组。

1.3.2分组及给药处理 手术后正常饲养，随机分为假手术组、模型组和实验组。30只/组。实验组大鼠给予腹腔注射淫羊藿苷100 μg/kg；假手术组、模型组给予同体积0.9%氯化钠注射液腹腔注射，1次/d，连续注射10 d。

1.3.3观察指标 分别在术后第2、4、8、12周，各组随机处死5只大鼠，取骨折处为中点长约1 cm股骨，收集标本，4%多聚甲醛固定，20%乙二胺乙酸(EDTA)脱钙，石蜡包埋，切片。切片组织学观察，分别进行HE染色和OPG免疫组织化学染色，采用图像分析仪计算OPG蛋白阳性表达积分光密度值(IOD)。在2、4、8、12 w对大鼠进行X线吸收仪扫描，以骨折端为中心测量骨痂骨密度，并对左下肢进行股骨骨密度检测。术后2、4、8、12 w，分别于处死前行心脏取血5 ml，常温静置2 h，低温条件下3 000 r/min离心10 min，收集血清，测定血清钙磷乘积及ALP。

1.4统计学方法 应用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1组织学HE染色结果 术后2 w，肉芽组织机化，出现软骨岛；与实验组相比，模型组软骨细胞数量、软骨岛面积较少。4 w时，模型组新生软骨大量增多，未见网织骨形成；而实验组除有新生骨增多，并有网织骨形成。术后第8周时，实验组仍有肥大的软骨细胞，开始形成大量骨小梁，间隙间可见毛细血管；而模型组有大量肥大的软骨细胞，且骨小梁少而细。术后12 w，实验组形成大量骨小梁，可见肥大的软骨细胞；而模型组骨小梁较少。假手术组骨骼正常。见图1。

图1 模型组、实验组不同时期HE染色结果(×100)

2.2OPG免疫组织化学染色结果 术后2 w，实验组可见骨膜内增生细胞增多，成骨细胞、肉芽组织中的成纤维样细胞及新生软骨细胞阳性广泛表达；而模型组阳性细胞着色浅，且表达数量明显较少。术后第4周，实验组上述细胞阳性持续表达，骨痂周围的成骨细胞数量明显高于模型组。术后第8周，实验组骨组织中阳性细胞数与阳性程度与前几周比有所下降，但软骨细胞阳性表达仍高于模型组。术后第12周，实验组软骨细胞着色呈阴性，多数肥大，阳性着色者为成骨细胞和周围的类骨质，而模型组的表达类似，但多数为软骨细胞，着色较浅。术后2、4、8、12 w，模型组OPG免疫组化图像IOD值分别为(155.04±2.62)、(124.25±7.48)、(133.58±4.22)、(84.67±4.20)，实验组分别(210.01±6.29)、(215.73±9.42)、(210.83±10.12)、(115.94±9.48)；在相同的时间段，与模型组相比，实验组IOD值明显较高(P<0.05)。

2.3不同时间大鼠骨密度测定结果 在相同的时间段，与模型组相比，实验组骨痂骨密度明显较高(P<0.05)；而左侧股骨骨密度两组在相同时间差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组相比，模型组和实验组左侧股骨骨密度均降低(P<0.05)。见表1。

2.4大鼠血清钙磷乘积及ALP检测结果 在相同的时间段，与模型组相比，实验组大鼠血清钙磷乘积略高，但差异无统计学意义(P>0.05)。实验组ALP水平明显高于模型组及假手术组(均P<0.05)。见表2。

图2 模型组不同时期OPG免疫组织化学染色结果(×100)

表1 不同时间段各组骨密度测定结果

与假手术组相比：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

表2 不同时间段各组血清钙磷乘积及ALP检测结果

与实验组比较：1)P<0.05

3 讨 论

骨质疏松临床治疗主要采用雌激素类、降钙素和钙制剂等，但副作用较大。骨质疏松性骨折属于中医中的“骨痿、骨疲”，与中医的“肾”有非常密切的关系。中医对骨折的治疗和促进骨折愈合方面有丰富的经验，其中以补肾理念为重要指导思想。淫羊藿小檗科植物，主在药用成分为淫羊藿苷，药理研究证实，淫羊藿能加速刺激骨髓细胞DNA的合成，刺激成骨细胞生长，对成骨细胞生长增殖具有一定的促进作用。动物实验研究表明，淫羊藿提取液对成骨细胞增殖作用有影响，且随剂量增加促进作用越强〔9,10〕。有研究报道〔11～13〕，淫羊藿苷具有诱导骨髓间充质干细胞成骨分化、抑制成脂分化的功能，可以促进成骨细胞的增殖分化。骨折修复的核心是成软骨细胞、成骨细胞前体的聚积、增殖和分化，OPG为骨代谢过程中骨再生的指标。研究显示，OPG具有抑制破骨细胞形成、分化、存活的功能，并诱导破骨细胞凋亡。本研究结果显示：实验组软骨生成及软骨内成骨过程较模型组明显较快，而且在各个相同时间点，实验组蛋白阳性表达的IOD值均较高，说明淫羊藿苷增加了软骨细胞的分化、增殖，促进成骨细胞和成熟软骨细胞OPG的表达，使骨形成加快，骨小梁形成增多，从而促进愈合。

ALP主要来源于骨组织，主要促进磷酸钙的生成而沉淀于骨组织内，而血液中钙磷含量又直接影响骨的钙化与溶解。本研究通过检测ALP及钙磷乘积水平发现，淫羊藿苷可以提高成骨活动，促进骨质疏松骨折愈合。

本实验结果提示，淫羊藿苷可以改善骨质疏松老年骨折大鼠愈合过程，这可能是通过提升软骨内成骨，加快矿化速度，增加骨痂和全身骨密度，促进OPG的表达，从而加快老年大鼠骨质疏松性骨折的愈合过程。

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