参附注射液对脓毒症老龄大鼠肾脏组织炎症因子表达的影响

冯 敏 刘 刚 徐大千

(郑州大学第一附属医院重症医学科，河南 郑州 450052)

脓毒症是一种具有全身性的炎症反应综合征，起病急，发展迅速，致死率高，常并发于严重创伤、烧伤、感染及大手术等多种应激状况，可诱发多器官病变，成为目前临床急危重症患者主要的死亡原因之一。约有17%的脓毒症病人会并发急性肾衰竭，损害中枢神经系统，发生电解质紊乱，导致尿毒症性肺部炎症，最终引起呼吸衰竭、死亡〔1,2〕。脓毒症的突出特征是炎症反应与抗炎反应失控。白细胞介素(IL)-6、CD14、IL-18在脓毒症发病机制中起关键作用，参与免疫和炎性反应的调控，可诱导急性期蛋白的合成，诱导炎症反应〔3～10〕。目前有关参附注射液对脓毒症方面的研究报道较少。本实验研究参附注射液对脓毒症大鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂 乌司他丁注射液，广东天普生化医药股份有限公司，批号：国药准字H20040506。尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及谷氨酸氨基转移酶(ALT)生化试剂(德国Prodia公司)，IL-6、CD14、IL-18试剂盒(美国Biosource公司),β2-免疫分析盒(北方生物技术研究所)，参附注射液(每毫升相当于生药：红参0.1 g，附片0.2 g，雅安三九药业有限公司)。

1.1.2动物 健康雄性SD大鼠136只，购于广东药学院实验动物中心，SPF级，体质量(350±20)g，许可证号SCXK(粤)2015-0022。本实验操作过程中及实验结束后，对各大鼠的处理方法均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2方法

1.2.1脓毒症大鼠模型制备与分组 脓毒症大鼠模型的制备方法参照文献〔11～14〕：造模前SD大鼠禁食12 h，以7.5 mg/100 g盐酸氯胺酮和2.0 mg/100 g赛拉嗪腹腔注射进行麻醉，固定于无菌操作台上，用碘酊进行常规消毒，沿中下腹正中线进行1.5 cm切口，在大鼠盲肠中部进行结扎，用16号针贯穿盲肠一次(为防止针孔闭合，留一条橡皮片贯通盲肠)，将盲肠还纳腹腔，缝合切口。术后立即注射5 ml 0.9%生理盐水，放回鼠笼，自由饮食。

分为正常组(不作任何处理，n=8)，假手术组(不结扎不穿孔，只于相同部位进行切口及盲肠提出后再放回,n=8)，模型组(脓毒症大鼠，n=40)，参附注射液中剂量组(脓毒症大鼠，n=40)，参附注射液低、高剂量组(脓毒症大鼠，n=8)，阳性药组(脓毒症大鼠，n=40)；前2组匀于尾静脉注射等量生理盐水，模型组于术后0、12、24、36、48 h经尾静脉注射等量生理盐水，参附注射液中剂量组于相同时间点经大鼠尾静脉注射参附注射液，每次剂量4 ml/kg(参考临床剂量)，低剂量组每次注射剂量为2 ml/kg，高剂量组每次注射剂量为6 ml/kg，阳性药组于相同时间点经大鼠尾静脉以100 000 U/kg注射乌司他丁注射液；模型组与参附注射液组分别于各时间随机取8只，采集标本。

1.2.2标本的采集与处理 SD大鼠麻醉、消毒后，无菌条件下开腹，剥离暴露出腹主动脉，采集腹主动脉血约5 ml，置于离心试管中，3 000 r/min低温高速离心10 min，取上层清液，于-80℃冰箱中保存，用于血清生化指标的测定；同样无菌操作下摘取肾组织，于-80℃冰箱中保存，用于组织形态学观察；用2 ml注射器从膀胱采集尿液，于-80℃冰箱中保存。

1.2.3血清及尿液中生化指标的测定 利用自动生化分析仪测定血清中Cr、BUN、ALT、K+及尿液中N-乙酰β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、Na+含量，计算尿钠排泄分数(FENa)。

1.2.4血清中IL-6及肾组织中IL-6、CD14、IL-18蛋白含量检测 将肾组织从-80℃冰箱中取出，称重后置于EP管中，加入15倍生理盐水，用匀浆器匀浆，以1 400 r/min低温离心15 min，吸取上清液；从冰箱中取出血清，于室温融化，采用Bio-rad蛋白检测试剂盒测定提取蛋白，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测肾组织和血清中的IL-6、CD14、IL-18蛋白含量。

1.3统计学分析 采用SPSS16.0统计，计量资料进行t检验、方差分析及相关回归分析。

2 结 果

2.1各组肾功能指标比较 与正常组相比，模型组从12 h开始血清中BUN明显升高(P<0.01)，虽然36 h呈现明显降低，但到48 h又再次显著升高(P<0.01)；同样，与正常组比较，36 h和48 h模型组血清ALT显著增加(P<0.05)；相较于血清中的BUN及ALT，大鼠血清中Cr含量增加缓慢，在48 h才表现出明显增加(P<0.05)。与模型组比较，脓毒症大鼠经各剂量参附注射液治疗12 h和48 h后，血清中BUN显著降低(P<0.05)，治疗36 h和48 h后血清中ALT显著降低(P<0.05)，而Cr虽也有所降低，但降低缓慢，于48 h后才明显降低(P<0.05)；与阳性药组比较，参附注射液各剂量治疗后效果明显优于阳性药组。给药48 h，参附注射液低剂量组治疗效果最差，与中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，说明有一定的剂量依赖性，而中、高剂量组间相比差异无统计学意义(P>0.05)，说明达到一定剂量后对治疗并没有表现出明显的效果。与正常组相比，48 h后模型组血清中的K+含量明显增加(P<0.05)；12 h后模型组血清β2微球蛋白明显升高(P<0.01)，但48 h后显著降低(P<0.01)。尿液指标检测显示，与正常组相比，12～36 h模型组的FENa均呈现降低(P<0.01)；而同时间点模型大鼠尿NAG含量差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，参附注射液各剂量组治疗12 h后大鼠血清β2微球蛋白降低(P<0.01)，而治疗组12～48 h FENa及NAG含量并没有明显变化；与阳性药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同给药剂量数据结果分析，给药48 h，参附注射液低剂量组治疗效果与中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，说明有一定的剂量依赖性，而中、高剂量组间相比差异无统计学意义(P>0.05)，说明达到一定剂量后对治疗并没有表现出明显的效果。见图1，图2。

图1 各组大鼠肾功能血清指标检测结果

2.2各组IL-6蛋白水平比较 正常组与假手术组大鼠血清中均含有少量IL-6，组间差异无统计学意义(P>0.05)。造模成功后12 h，与正常组相比，模型大鼠血清中IL-6蛋白表达水平明显增加(P<0.05)，24 h达到最高(P<0.01)，而至36 h血清中IL-6蛋白表达水平下降显著，接近于正常组，但48 h又明显升高(P<0.01)；模型组肾脏组织中IL-6蛋白表达水平从12～36 h有缓慢升高表现，与正常组差异有统计学意义(P<0.01)，而至48 h又下降至与正常组持平水平。与模型组相比，参附注射液治疗后，各剂量组12～48 h大鼠血清中IL-6蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，12 h肾脏组织中IL-6水平却无显著变化，而24～36 h肾脏组织中IL-6蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；脓毒症大鼠经参附注射液治疗后，效果明显优于阳性药组。参附注射液具有一定的剂量依赖性，且中、高剂量组间相比差异无统计学意义(P>0.05)，说明达到一定剂量后对治疗并没有表现出明显的效果。见图3。

2.3各组肾脏组织中CD14、IL-18蛋白相对含量比较 模型组肾脏组织中CD14蛋白表达水平最高，而阳性组与参附注射液各剂量组肾脏组织中CD14蛋白表达水平与模型组相比明显降低(P<0.01)。与对照组相比，模型组IL-18蛋白表达水平明显增高(P<0.01)；与模型组相比，参附注射液高、中、低组肾脏组织中IL-18蛋白表达水平明显减少(P<0.01)。见图4。

图2 各组大鼠肾功能尿液指标检测结果

图3 各组大鼠IL-6蛋白水平的检测结果

图4 大鼠肾脏组织中CD14、IL-18蛋白相对含量

3 讨 论

炎症反应是引起多器官功能障碍的主要因素，炎细胞的持续活化与播散导致炎症介质过多产生与释放，引起细胞乃至脏器损伤，严重者导致多脏器衰竭。研究显示，通过激活炎症因子可导致核转录因子(NF)-κB活化入核，引起IL-6，IL-18等炎症因子的合成与释放。参附注射液由红参、附子组成，人参皂苷和乌头碱为主要活性成分，具有温阳益气养心、回阳救逆的药效。研究显示，参附注射液对脓毒症患者或动物具有一定的改善及保护作用，调节脓毒症免疫紊乱及维持机体炎症平衡〔15,16〕。脓毒症可引起多种器官损伤，肾脏损伤是其常引起的并发症，本研究结果显示，参附注射液对脓毒症炎症大鼠肾脏具有明显的保护作用，其通过抑制血清与肾组织中的IL-6、CD14、IL-18蛋白表达水平，抑制炎症因子的释放，实现参附注射液对脓毒症大鼠的肾脏保护作用。

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